研究背景及目的支气管哮喘是一种异质性疾病,通常以慢性气道炎症为特征。全世界范围内约有超过3亿人患哮喘,我国目前约有3000万哮喘患者,哮喘发病率呈不断增高的趋势。职业性哮喘占全部成年期发病哮喘的10%左右,其中甲苯二异氰酸酯(Toluene Diisocyanate, TDI)是报道最多的职业性哮喘的常见病因,这可能是由于甲TDI广泛用于工业生产。TDI哮喘的临床表现和病理变化与过敏性哮喘大致相同,但目前针对TDI哮喘的发病机制研究并不多。我们课题组前期已经建立了一个稳定的TDI诱导的以气道TH2炎症反应为主导,伴随气道中性粒细胞和嗜酸性粒细胞浸润的哮喘小鼠模型。高迁移率族蛋白-1(high mobility group box 1, HMGB1)是一种DNA结合蛋白,属于警报素家族。它作为自身免疫的的一个关键分子,同时是持续性组织损伤下游的一个重要的效应器。HMGB1调节炎症、干细胞召集和激活,最后引起组织修复。以上过程既可发生于细胞激活,也可发生在细胞死亡过程中。所以HMGB1被视作自身免疫的关键性调节因子。最近,有报道证明更高水平的HMGB1与哮喘患者受损的肺功能和更严重的疾病状态相关。而我们的前期研究已经在TDI诱导的哮喘小鼠模型上证实HMGB1在肺组织表达增加与过敏性气道炎症的相关性。但在肺组织中HMGB1的调控机制尚未被阐明。现有观点普遍认为炎症体是是炎症和自身免疫的一种关键介质。目前已经有越来越多的研究证明NLRP3炎症体参与过敏性哮喘的气道炎症过程。炎症体是通过调节其效应器半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)来发挥作用的。而caspase-1可切割前炎症因子proIL-1β and proIL-18,使其成为活性形式IL-1β,IL-18,并促进IL-1β, IL-18的释放,从而引起炎症反应的启动和扩大。近来,有文献报道认为HMGB1是炎症体和caspase-1的另外一个重要的靶分子。也有数项研究提示caspase-1在过敏性疾病中发挥重要作用。值得注意的是,越来越多的研究表明,炎症体,caspase-1和HMGB1与中性粒细胞炎症相关。磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Ks)是一组家族蛋白,可磷酸化位于细胞膜的磷脂酰肌醇肌醇环的3-OH位点,形成磷脂酰肌醇(3、4、5)三磷酸。PI3K在所有真核细胞反应中扮演一个重要角色,包括细胞生存、增殖、分化和细胞迁移,磷酸肌醇(3、4、5)三磷酸激活各种下游信号通路。PI3K已被广泛证明参与各种病理过程如癌症、炎症和过敏等。研究还表明,PI3K通路在哮喘的发病过程中发挥至关重要的作用。已有体外试验已证明,PI3K参与caspase-1激活,以及下游IL-1β、IL-18的成熟和分泌、还有HMGB1核浆转位。然而,它是否在体内试验,如在哮喘模型中同样涉及caspase-1激活和下游IL-1β以及HMGB1的产生还未被证明,有待进一步研究。基于上述的证据,我们提出假设：1.在TDI诱导的哮喘小鼠模型中,PI3K信号通路介导肺组织HMGB1的产生。2.NLRP3炎症体和caspase-1在这个过程中发挥作用。研究内容第一部分：根据TDI哮喘的特点,参考课题组前期造模方式建立TDI诱导的哮喘小鼠模型;在此模型的基础之上给予PI3K抑制剂LY294002干预(腹腔注射),观察小鼠过敏性气道炎症的变化以及小鼠肺组织中HMGB1的变化情况。第二部分：给予PI3K抑制剂LY294002干预后,观察TDI哮喘小鼠肺组织中NLRP3炎症体是否有激活。材料与方法6周龄的SPF级雄性BALB/c小鼠48只,体重为20-22 g(购于南方医科大学实验动物中心)。丙酮、橄榄油、TDI、乙酰甲胆碱；LY294002; HE染液,PAS染液;DAB显色试剂盒。小鼠IgE、白细胞介素-4 (IL-4) ELISA试剂盒。HMGB1一抗、caspase-1、IL-1β、NLRP3一抗。1.动物模型的制备BALB/c小鼠在南方医科大学实验动物中心具有12小时明暗周期的SPF级别动物房饲养,所有实验操作严格遵守南方医科大学动物学科委员会管理规范。48只小鼠随机分为4组：(1)AOO组(即对照组,用AOO致敏、AOO激发、PBS处理,其中AOO是TDI的溶剂)；(2)TDI组(即实验组,用TDI致敏、TDI激发、PBS处理)；(3) TDI+LY294002组(即PI3K干预组,用TDI致敏、TDI激发、LY294002处理)：(4) TDI+DMSO组(用TDI致敏、TDI激发、DMSO处理,其中DMSO是LY294002的溶剂)。AOO组：第1天、第8天致敏,具体方法：将丙酮和橄榄油的混合液(体积比为2：3)20微升滴到小鼠耳背部,40 uL／只小鼠；第15天、第18天、第21天给予雾化吸入激发,具体方法：将小鼠放进雾化箱,用移液枪将丙酮橄榄油混合液(体积比为1：4)放进压缩空气雾化装置持续雾化2小时。每次激发前1小时按50uL每只的剂量腹腔注射生理盐水。TDI组：第1天、第8天致敏,具体方法：0.3%TDI 20uL(丙酮和橄榄油体积比为2：3)滴到小鼠耳背部,40uL/只小鼠；第15天、第18天、第21天给予雾化吸入激发,具体方法：将小鼠放进雾化箱,用枪将3%TDI(溶于体积比为1：4的丙酮和橄榄油混合液)放进雾化装置,持续雾化2小时。每次激发前1小时按50uL每只的剂量腹腔注射生理盐水。TDI+LY294002组操作过程同TDI组,每次激发前1小时按1.5mg/kg剂量腹腔注射LY294002 (LY294002溶于DMSO,用0.9%NaCl稀释至50uL)。作为对照,TDI+DMSO组,与TDI+LY294002组操作过程同,每次激发前1小时腹腔注射等剂量的DMSO(DMSO用0.9% NaCl稀释至50uL)。2.气道高反应性检测小鼠气道高反应性检测于第3次激发结束后24h进行,简要过程如下：将小鼠置于气压体积描记仪主仓内,用乙酰甲胆碱按递增浓度(浓度0-10mg/mL)加入雾化器,雾化后乙酰甲胆碱进入气压体积描记仪主仓,每个浓度雾化后检测3min,同时观察小鼠反应,BUXCO无创肺功能检测仪记录小鼠的气道反应性指标Penh (enhanced pause)。3.动物处死和取材小鼠肺功能测量结束后24h,用致死量的戊巴比妥钠(100 mg/kg体重)腹腔内注射麻醉处死小鼠,给予小鼠眼球摘除,取血,将全血静置1h后,离心20分钟,转速3000转／分,取上清,-80℃保存备用。将每只小鼠的颈部淋巴结分离摘除,予气管插管,用缝线固定导管,行肺泡灌洗术：用0.8mL的预热的生理盐水(0.9% NaCl,37℃)缓慢、轻柔地注入肺内,继之回抽,重复3次,最后收集肺泡灌洗液于EP管内。然后,将导管插入左肺,往左肺注入4%福尔马林中性缓冲液0.2mL行内固定,摘除左肺,置于4%福尔马林中性缓冲液进行外固定,常温保存,作以后病理切片备用;摘除右肺-80℃保存,作以后免疫印迹备用。4.淋巴细胞培养及淋巴上清IL-4检测将上述摘除的各组小鼠颈部淋巴结分别放入1.5m1 EP管,所有EP管均置于冰上,加入1.0mL RPMI-1640。将EP管中淋巴结转移至40μm细胞筛上,眼科镊轻轻挤压,10mL RPMI-1640冲洗,15mL离心管收集冲洗液,取10uL冲洗液计数细胞,剩余冲洗液予1000转／分,离心3分钟,弃上清液,用RPMI-1640重悬至细胞浓度为107/ml,准备48孔板,每孔加入900uL全培养基(RPMI-1640含10%FBS及5 mg/mL刀豆球蛋白A),将100uL的细胞悬液加入其中使得细胞浓度为106/mL。放置37℃培养箱43小时。培养结束后取培养液1000转／分离心10分钟,上清分装,放置-80℃保存,用于检测IL-4。5.血清IgE血标本收集后室温静置1小时,3000转离心共20分钟,收集上清并储存于-80℃备用。根据试剂盒说明书用ELISA法检测血清总IgE。6.支气管肺泡灌洗液(BAL)检测肺泡灌洗液回收后即进行细胞总计数。然后1200r/min离心10min,上清用于检测IL-1p。离心沉淀细胞涂片经HE染色,按细胞形态进行巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞进行分类计数(至少计数200个细胞)。7.肺组织病理学观察肺泡灌洗结束后,迅速用10%多聚甲醛固定左肺24 h,经脱水,透明后石蜡包埋,再切片(4μm),最后行HE染色、光镜下光镜观察支气管粘膜炎性细胞浸润情况、上皮细胞增生程度等病理改变以及上皮细胞基底膜中性粒细胞、嗜中性粒细胞及嗜酸性粒细胞浸润情况。8.免疫组化及蛋白印迹按照免疫组化染色试剂盒说明操作,检测目标分子HMGB1, caspase-1, IL-1β及NLRP3,阳性细胞着色表现为染成棕褐色。提取右肺组织蛋白,变性,10%聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜2h,5%脱脂奶粉封闭2h,分别用目标分子HMGB1, caspase-1, IL-1β和NLRP3的一抗4℃孵育过夜,用同种属的荧光二抗常温孵育1h, Odyssey(?) CLx显影。9.统计学处理采用SPSS19.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准误表示,多组间总体均数比较采用单因素方差分析one-way ANOVA,多组间比较用Bonferonni post hoc test,以p<0.05为有统计学意义。结果1.LY294002对TDI诱导的哮喘小鼠PI3K信号通路的影响为确认PI3K抑制剂LY294002对PI3K信号通路的作用,我们检测p-Akt, PI3K最重要的下游分子。我们发现与AOO组相比,TDI组小鼠在TDI致敏和激发后,肺组织p-Akt的表达可显著上调(p<0.05),而TDI+LY294002组中,LY294002预处理可显著减轻TDI诱导的p-Akt表达上调(p<0.05). TDI+DMSO组p-Akt表达与TDI组相似,表明LY294002的溶媒DMSO本身并不影响p-Akt表达(p>0.05)。2.PI3K介导TDI诱导的哮喘小鼠气道高反应性和过敏性气道炎症首先,PI3K介导TDI诱导的气道高反应性。与AOO相比,在递增浓度的乙酰甲胆碱(1.25、2.5、5、10mg/mL)刺激后,TDI组小鼠的Penh值显著增加(p<0.05)。所有这些改变在LY294002治疗后部分恢复(p<0.05)。再者,与AOO组相比,TDI组哮喘小鼠血清总IgE的释放显著增加(p<0.05),以及淋巴细胞上清培养液的IL-4明显增加(p<0.05),而PI3K抑制剂LY294002预处理均可使两者明显降低(p<0.05)。最后,我们评估小鼠肺泡灌洗液总细胞数,以及巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞分类计数。无论是总细胞数,还是中性粒细胞或嗜酸性粒细胞计数,均在TDI刺激后明显增多(p<0.05)。肺组织学检查显示出类似的结果,暴露于TDI的小鼠肺组织中发现更多的炎症细胞浸润和显著的上皮增殖。LY294002同样可以部分逆转TDI诱导的BALF和肺组织中的这些改变(p<0.05)。3.PI3K参与了肺组织HMGB1的生产及其核浆转位免疫印迹结果示：和上述气道高反应性和过敏性气道炎症一致,肺组织HMGB1的蛋白表达水平在TDI组小鼠比AOO组显著增高。通过免疫组织化学染色检查小鼠肺组织切片也可获得类似的结果：在AOO组,HMGB1几乎只分布在肺组织各种细胞的细胞核,然而,3次TDI激发后,HMGB1从细胞核转位到细胞浆,弥漫分布于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、气道成纤维细胞和浸润于肺组织的各种炎症细胞。值得注意的是,在PI3K抑制剂LY294002预处理后,无论是HMGB1在肺组织的高表达,还是其核浆转位均在很大程度上得到减轻(p<0.05)。4.LY294002对肺组织caspase-1激活的影响为进一步探讨PI3K是通过什么机制调节TDI诱导的过敏性气道反应过程中HMGB1生产和释放,我们测量HMGB1最为人所公认的上游分子caspase-1。首先,使用免疫组织化学的方法,我们发现,TDI致敏和激发后,小鼠肺组织表达的caspase-1明显增多,支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞、各种炎症细胞细胞浆内可见非常浓厚的caspase-1分布,同样地,LY294002预处理大大减弱这种TDI诱导的caspase-1上调。然后,我们通过免疫印迹检测caspase-1的前体procaspase-1 (45KD)和成熟体caspase-1 (20KD)在肺组织的蛋白质含量,可见：与AOO组相比,TDI组小鼠肺组织成熟体caspase-1(而不是前体procaspase-1)的蛋白质水平显著升高(p<0.05)。这表明我们通过免疫组织化学染色观察到的TDI诱导的caspase-1表达增加主要是由于成熟体caspase-1构成。我们进一步发现,这种增加的caspase-1表达在PI3K抑制剂LY294002预处理后明显逆转(p<0.05),而procaspase-1在各组小鼠肺组织的表达几乎保持不变(p>0.05)。这些数据表明,TDI诱发哮喘小鼠中肺组织caspase-1的激活,而PI3K活性是caspase-1成熟的关键。5.LY294002对肺组织IL-1μ生成的影响为进一步确认PI3K在caspase-1激活中的作用,以及探讨PI3K参与调控TDI诱发哮喘的下游机制。我们检测炎证因子IL-1p,一个众所周知的caspase-1下游的靶分子。免疫组织化学染色可见,在AOO组,微量的IL-1p在肺组织表达,而在TDI组,TDI暴露可使更多的IL-1μ表达于肺泡上皮细胞、支气管气道上皮细胞以及气道周围浸润的炎性细胞细胞浆。同样地,LY294002能显著减少TDI诱导的IL-1p在细胞浆中的表达。通过免疫印迹可以获得类似的结果：TDI诱导的IL-1p成熟体(17KD)高表达(p<0.05)几乎能被PI3K抑制剂LY294002预处理所消除(p<0.05)。另一方面,TDI刺激后proIL-1β(31KD)表达增加(p<0.05),在LY294002预处理后又显著减少(p<0.05)。但我们中始终未能通过ELISA方法检测到在各组小鼠肺泡灌洗液中IL-1μ水平。此外,NLRP3,作为caspase-1的上游分子,也是NLRP3炎症体的感受器,尽管丰富地表达于支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞以及周围浸润的炎性细胞,但其分布部位和蛋白表达水平,无论在TDI刺激后还是LY294002预处理后都保持不变(p>0.05)。结论：1.在TDI诱导的小鼠哮喘模基础上,证明PI3K信号通路介导TDI诱导的过敏性气道炎症以及肺组织HMGB1的产生和核浆转位；2.PI3K参与肺组织caspase-1激活及IL-1p生成,TDI可能通过此机制诱发HMGB1的产生以及过敏性气道炎症。