研究背景：　　支气管肺发育不良(BPD)是一种在存活早产儿中发病率较高的慢性肺部疾患。而近年来随着医疗技术的发展早产儿的存活率明显增加，其发病率也相应增高。氧疗是一个临床常用的治疗手段，而高浓度氧的长时间吸入，会导致高氧肺损伤（HLI），HLI在BPD的发生和发展中发挥了重要的作用。BPD的典型病理改变是与肺细胞增殖密切相关的肺泡化受阻以及不成熟肺组织的异常修复。肺泡II型上皮细胞(AECⅡ)作为肺泡上皮的干细胞，具有分化为肺泡Ⅰ型上皮细胞（AECⅠ）的能力，在肺损伤后肺泡结构和功能的修复均有赖于AECⅡ增殖和分化。降钙素基因相关肽（CGRP）是一种具有广泛调节功能的神经肽，其功能除了血管调节之外，对多种器官具有保护作用，并对多种类型的上皮和内皮细胞的增殖有着重要的影响。Notch信号通路已被证实在绝大部分细胞分化、增殖和凋亡及其他一系列生理、病理过程中起着广泛且关键的调控作用。现有的研究表明，CGRP对高氧损伤的AECII有一定的保护作用，探讨CGRP对高氧损伤AECⅡ的Notch信号通路的影响及Notch信号通路在其中发挥的作用，可为CGRP或Notch通路调节因子在HLI及BPD临床防治方面的转化应用奠定基础。　　目的：　　1.探讨95%体积分数氧气暴露早产大鼠AECⅡ的氧化应激及凋亡的情况及对Notch信号通路的影响。　　2.分别利用Notch通路阻断剂DAPT以及siRNA沉默Notch1基因的方式干预Notch通路，探讨CGRP对高氧损伤的AECⅡ的保护作用是否有Notch信号通路的参与。从而为HLI和BPD的发病机制的研究和临床防治提供新的思路。　　方法：　　1.孕19d SPF级Sprague-Dawley（SD）大鼠腹腔注射常规麻醉，经剖宫产取出胎鼠，手术提取肺脏，予剪碎组织并消化，采用差速离心和差速贴壁法分离纯化AECⅡ，并进行培养。全自动细胞分析仪检测AECⅡ数量及活力，应用免疫组化法及透射电镜观察对AECⅡ进行鉴定，通过倒置相差显微镜下观察AECⅡ生长情况。采用本实验室自主研发的密闭高氧装置通入95%O2进行早产鼠原代AECII高氧模型的建立。　　2.在Notch通路阻断相关研究中，将分离纯化培养后的早产SD大鼠原代AECⅡ，随机分为6组：A.常氧组：细胞置于氧浓度为21%的密闭氧仓再放入5%CO2孵箱进行孵育培养；B.高氧组：细胞置于含有95%O2的密闭氧仓中放入5%CO2孵箱进行孵育培养；C.高氧+CGRP组：细胞培养液中预先加入CGRP，再行高氧处理；D.高氧+CGRP+CGRP8-37组：细胞培养液中预先加入CGRP与CGRP受体抑制剂CGRP8-37，其余处理同高氧组。E.高氧+DAPT组：细胞培养液中预先加入Notch通路阻断剂DAPT，其余处理同高氧组。F.高氧+DAPT+CGRP组：细胞培养液中预先加入Notch通路阻断剂DAPT和CGRP，其余处理同高氧组。培养24小时后观察AECⅡ的形态变化；流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞内活性氧（ROS）；检测丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性；应用Q-PCR检测培养细胞Notch通道受体Notch1mRNA表达水平；Western blot方法检测Notch下游靶基因HERP蛋白水平。　　3.预先设计合成三条Notch1干扰序列及引物，选用干扰效率最强的序列，以质粒为载体对AECⅡ进行转染，建立早产鼠AECⅡNotch1基因siRNA干扰模型。　　4.在siRNA干扰相关研究中，将早产大鼠原代AECⅡ分离纯化后，随机分为5组：　　(1)高氧组；细胞置于含有95%O2的密闭氧仓中放入5%CO2孵箱进行孵育培养；　　(2)空白质粒转染组:转染空白质粒后高氧环境培养；　　(3)siRNA干扰组：siRNA干扰后高氧环境培养；　　(4)空白质粒＋CGRP组：空白质粒转染，培养液加入CGRP高氧环境培养；　　(5)siRNA干扰＋CGRP组：siRNA干扰，培养液加入CGRP高氧环境培养；各组细胞培养24小时后检测细胞凋亡率、ROS、MDA、SOD及Notch1mRNA表达及HERP蛋白水平。　　结果：　　1.通过本实验室方法原代培养的AECⅡ产量较好，AECⅡ光镜下外形为多边形岛状分布，细胞间紧密连接且胞核明显、胞浆有大量颗粒性物质；应用全自动细胞分析仪检测，每只胎鼠分离得到的总细胞数达到（8.0±1.5）×106个，活细胞占98%±1.5%，细胞数量及细胞活力合格，AECⅡ占总细胞数的97%±2.0%，细胞纯度合格；透射电镜下细胞膜可见微绒毛，胞浆内可见大量嗜锇性板层小体。免疫组化可见AECⅡ胞浆呈棕色反应。　　2.与常氧组比较，高氧暴露24小时后AECⅡ凋亡率明显增加，ROS和MDA水平显著升高，SOD活性明显下降（P＜0.05），同时AECⅡNotch通路受体Notch1 mRNA表达和靶基因HERP蛋白水平显著降低（P＜0.05）；　　3.与高氧组比较，CGRP干预可上调Notch1mRNA和HERP的表达（P＜0.05），同时可明显降低AECⅡ凋亡率，下调ROS和MDA，使SOD活性增高（P＜0.05）。应用CGRP8-37后部分对抗了CGRP的上述生物学作用。　　4.经Notch通路阻断剂DAPT干预处理，可使Notch1mRNA和HERP蛋白表达较高氧组进一步降低，同时使AECⅡ在高氧暴露24小时后凋亡率、ROS和MDA水平进一步升高，SOD活性进一步下降（P＜0.05）；而进行CGRP干预后可使上述改变减轻（P＜0.05）,同时Notch通路的受体Notch1mRNA和靶基因HERP表达增加（P＜0.05）。　　5.高氧组与空白质粒转染组在凋亡率、ROS、SOD、MDA、Notch1mRNA和HERP蛋白水平均无统计学差异(P＞0.05)；与空白质粒转染组相比，siRNA干扰组AECⅡ高氧损伤后Notch1mRNA和HERP蛋白表达明显降低（P＜0.05），氧化损伤加重，细胞凋亡率增高；空白质粒转染＋CGRP组和siRNA干扰＋CGRP组，Notch1mRNA和HERP蛋白表达分别比未加入CGRP所对应组有所增高，细胞凋亡率降低（P＜0.05）。　　结论：　　1.通过采用实验室常规的差速贴壁和差速离心法所获取的AECⅡ产量较多，细胞纯度高、活力好，符合进一步的细胞学实验研究要求。　　2.高氧（95%体积分数）可导致AECⅡ氧化损伤，促进AECⅡ凋亡，使Notch1mRNA和靶基因HERP表达下降；阻断Notch通路能使Notch1mRNA和HERP表达进一步下降，同时氧化损伤加重，初步提示Notch参与了高氧对于AECII的生物学效应。　　3.CGRP可减少高氧暴露所致AECⅡ的凋亡，减轻其氧化损伤，从而对高氧肺损伤起到一定的保护作用，同时CGRP可促进Notch1mRNA和靶基因HERP表达；而CGRP8-37则可部分对抗CGRP的作用，并下调Notch1mRNA和靶基因HERP表达；而阻断Notch通路可使其保护作用减弱，提示通过促进Notch信号通路的表达，可能是CGRP对高氧损伤AECⅡ发挥保护作用的机制之一。而CGRP8-37则可部分对抗CGRP的作用。　　4.本研究通过脂质体转染方式建立了早产鼠AECⅡNotch1 siRNA干扰模型，有效地下调了Notch1及靶基因HERP的表达。观察到Notch1基因沉默可增加高氧损伤AECⅡ的凋亡率，氧化应激加重。加用CGRP可使Notch1mRNA和靶基因HERP水平一定程度地上调，与此同时AECⅡ的氧化损伤减轻，进一步验证了Notch信号通路可能参与CGRP对高氧损伤AECⅡ损伤的保护作用。