苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是世界上应用面积最广、研究最为深入、应用最成功杀虫微生物。营养期杀虫蛋白(Vegetative Insecticidal Proteins,Vips)是一类BT在营养期分泌的新型杀虫蛋白。本论文分析了营养期杀虫蛋白Vip3A对鳞翅目林木害虫的生物活性,构建了vip3A(a)基因植物表达载体,对植物转化方面进行了研究。1.Bt营养期杀虫蛋白对鳞翅目林木害虫生物活性研究Bt产生的伴孢晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)对多种农林重要害虫有很高的生物活性,营养期杀虫蛋白是一类与BT伴孢晶体蛋白杀虫机理不同的新型蛋白,Vip3A蛋白对多种重要农业害虫有活性,而该类蛋白对林木重要害虫美国白蛾(Hyphantria cunea)和杨扇舟蛾(Clostera anachoreta(Fabricius))的生物活性研究尚未见报道。本实验利用本实验室克隆的苏云金芽孢杆菌Vip3A-LS1和Vip3A-LS8基因,构建了原核表达重组质粒pPV113和pPV116,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,SDS-PAGE分析均检测出约88kD的Vip3A蛋白。生物学活性检测结果表明,重组蛋白对初孵美国白蛾幼虫和杨扇舟蛾初孵幼虫均有较高的杀虫活性,当用80μg/g(蛋白/饲料)的Vip3A-LS1蛋白处理初孵美国白蛾幼虫时,平均校正死亡率达到(53.02±0.43)%,体重抑制率达到了80.60%,对杨扇舟蛾初孵幼虫平均校正死亡率达到(68.00±0.60)%;同浓度的Vip3A-LS8蛋白对初孵美国白蛾平均校正死亡率达(52.12±0.53)%,体重抑制率高达78.90%,对杨扇舟蛾初孵幼虫平均校正死亡率达到(70.0±0.53)%,首次发现Vip3A蛋白对林木重要害虫有较高杀虫活性。2.vip3A(a)转基因植物表达载体的构建和植物转化研究生物农药虽然对环境的负面影响较少,但也存在防治效果较差、不稳定等缺陷。随着植物基因工程研究的深入,通过基因工程改造获得抗虫植物已经成为生物防治热点,其中Bt基因在林木特别是杨树的转化已有成功报道。为克服靶试昆虫对单一基因表达产物产生抗性,多基因或者不同抗虫机制基因的转化已经成为相关研究的热点。本研究拟将vip3A(a)基因通过农杆菌介导方式转化含有Cry1A和ApIA双抗虫基因的转基因杨树,研究转化子的抗虫性,以及转化子在基因和表达产物水平的协同效应。以重组质粒pPV113和pPV116为模板,根据已发表的vip3A(a)基因序列,参照文献设计的引物扩增出一条大约2.37kb目的片断,将其目的片断插入植物表达载体pBI121,把pBI121上的表达框架插入pCAM1302的多克隆位点,构建了p1302PI113和p1302PI116两个表达载体。利用农杆菌介导法将构建好的含有Vip3A基因的植物表达载体对毛白杨雄株和已含Bt基因的转基因杨树组培苗进行转化。得到单抗和多抗虫转化芽,经PCR检测和GFP组织化学分析,证明外源Vip3A基因已初步整合到杨树基因组DNA中,这一工作正在进行中。