论文部分内容阅读
目的:本课题旨在研究苹果酸舒尼替尼对肠癌发生发展的调控作用,并探讨其作用机制。通过体内ApcMin/+小鼠模型与体外结肠癌HCT116细胞模型相结合,从体内外探究苹果酸舒尼替尼调控肠癌发生发展作用并揭示其分子机制,为苹果酸舒尼替尼对肠癌的治疗提供更多的实验理论依据。方法:1.体内实验体内实验采用10周龄雄性ApcMin/+小鼠和野生型小鼠,实验分为野生型溶媒组、ApcMin/+溶媒组和ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组,除ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组小鼠给予以30mg/kg的剂量的苹果酸舒尼替尼（溶解在0.9%生理盐水）外,其余溶媒组给予等体积0.9%生理盐水。（1）连续给药9周后,停止给药观察记录ApcMin/+溶媒组和ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组小鼠的总体生存时间和体重减轻速度。（2）解剖观察各组小鼠脾脏指标,检测外周血中红细胞、血红蛋白和白细胞数量。（3）解剖观察ApcMin/+溶媒组和ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组小鼠肠道息肉的数量;苏木精-伊红染色法（HE）观察测定各组肠道息肉的大小。（4）免疫组织化学法（IHC）检测小鼠肠道组织中β-catenin蛋白的表达水平和入核情况。（5）蛋白质免疫印迹（Western Blotting）法检测各组小鼠肠道组织中PCNA、BCL-6、全长Caspase-3和Cleaved-Caspase-3蛋白的表达水平。（6）荧光定量PCR（q-PCR）法检测各组小鼠肠道组织中c-Myc和炎症相关细胞因子IL-1α、IL-1β、IFN-γ、IL-6和TNF-αm RNA的表达水平。2.体外实验体外实验选择结肠癌细胞株HCT116作为实验细胞,设立对照组和给药组。（1）CCK8法和细胞克隆实验法检测苹果酸舒尼替尼对HCT116细胞增殖的影响。（2）细胞划痕实验和Transwell法检测苹果酸舒尼替尼对HCT116细胞迁移的影响。（3）Western Blotting法（WB）检测各组HCT116细胞内JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3、c-Myc和Twist蛋白的表达水平。结果:1.体内实验结果（1）与ApcMin/+溶媒组相比,结束给药后,ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组小鼠的总体生存时间显著延长（P＜0.0001）,同时也显著减缓ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组小鼠的体重减轻速度（P＜0.0001）。（2）与ApcMin/+溶媒组相比,ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组小鼠的脾脏指标明显恢复至野生型溶媒组水平;其中外周血中的红细胞和血红蛋白数量升高,白细胞数量下降（P＜0.01）。（3）小鼠肠道息肉情况:与ApcMin/+溶媒组相比,ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组肠道总息肉数量以及各肠段息肉数量都明显减少（P＜0.001）。HE结果来看,ApcMin/+溶媒组肠道息肉尺寸明显大于ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组。（4）IHC检测结果:与ApcMin/+溶媒组相比,野生型溶媒组中的入核β-catenin蛋白积分光密度值明显下降;ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组中的入核β-catenin蛋白积分光密度值明显小于ApcMin/+溶媒组（P＜0.001）。（5）WB检测各组小鼠肠组织蛋白表达量:与ApcMin/+溶媒组相比,ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组肠道细胞增殖标记蛋白PCNA表达水平下调。与野生型溶媒组相比,ApcMin/+溶媒组肠组织中BCL-6蛋白表达水平显著上升;而与ApcMin/+溶媒组相比,ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组BCL-6蛋白表达量明显下降且基本恢复至野生型溶媒组水平;而全长Caspase-3蛋白的表达情况与BCL-6相反。（6）各组小鼠肠道组织中c-Myc以及相关炎症细胞因子m RNA的表达量:野生型溶媒组肠道组织中c-Myc m RNA表达量明显低于ApcMin/+溶媒组（P＜0.001）,而与ApcMin/+溶媒组相比,ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组肠道组织中c-Myc m RNA水平显著降低（P＜0.001）;在治疗6周后,与ApcMin/+溶媒组相比,ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组肠道中IL-1α、IFN-γ、IL-6和TNF-α的m RNA水平显著下调（P＜0.01,P＜0.001）,但IL-1β没有明显的变化;在治疗9周后,ApcMin/+苹果酸舒尼替尼组肠道中IL-1α、IFN-γ、IL-6和TNF-α的m RNA下调至野生型溶媒组水平（P＜0.001）,IL-1β也显著下调（P＜0.001）。2.体外实验结果（1）CCK8法和细胞克隆实验结果显示,苹果酸舒尼替尼对结肠癌细胞HCT116的增殖有明显的抑制作用（P＜0.001）,并随浓度的增加抑制作用升高,呈现剂量依赖关系。（2）根据细胞划痕实验和Transwell实验结果可知,苹果酸舒尼替尼对细胞HCT116的迁移有明显的抑制作用（P＜0.001）。（3）WB结果显示:与对照组相比,高、中、低剂量组细胞中JAK2、STAT3蛋白表达量没有改变,而P-JAK2、P-STAT3、c-Myc和Twist蛋白表达水平明显降低（P＜0.05P＜0.01）。结论:1.苹果酸舒尼替尼可以显著延长雄性ApcMin/+小鼠的总生存时间,减慢小鼠体重下降的速度,改善脾脏、血液（红细胞、血红蛋白和白细胞）指标,减少小鼠肠道息肉的数量并缩小息肉尺寸,且其分子机制可能是通过下调相关炎症细胞因子表达、抑制β-catenin/c-Myc通路并反转Bcl-6和Caspase-3水平。2.苹果酸舒尼替尼可以明显抑制HCT116细胞的增殖和迁移,其机制可能是通过调节JAK2/STAT3通路的活性来下调c-Myc和Twist蛋白的表达。