1背景欣梦颗粒处方以桑椹、酸枣仁、丹参、五味子等五味中药组成,以滋阴补肾、养心安神为治疗法则,用于治疗失眠之心肾两虚症。由重庆华森药业与西南大学联合开发,按照国家中药六类新药规范研制,已经获得国家技术发明专利,及国家重大新药创制专项资助,已经进入II期临床试验阶段。2目的测定欣梦颗粒主要有效成分含量;进一步观察欣梦颗粒镇静催眠作用的量效关系、最佳给药时间、最佳给药疗程和药物耐受性,并研究其作用机制,为临床用量、用药时机、使用疗程提供科学依据。3方法3.1欣梦颗粒主要药效成分的含量测定采用HPLC测定欣梦颗粒主要药效成分原儿茶醛、斯皮诺素、阿魏酸和五味子醇甲含量。所使用的色谱条件是:以Xterra RP18色谱柱(250 mm×4.6 mm×3.5μm)为色谱柱;以A-甲醇,B-0.1%冰乙酸溶液(调节p H至3.3)为流动相进行梯度洗脱;以235 nm(原儿茶醛、五味子醇甲)和335 nm(斯皮诺素、阿魏酸)为检测波长;流速0.5 m L/min;柱温30℃。3.2欣梦颗粒镇静催眠作用研究采用小鼠自主活动、阈下剂量和阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠实验,观察欣梦颗粒7个剂量组(0.375 g/kg、0.75 g/kg、1.5 g/kg、3 g/kg、6 g/kg、12 g/kg、24 g/kg)对小鼠自主活动、阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠入睡率以及阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠入睡潜伏期和睡眠持续时间的影响,考察其量效关系。设置欣梦颗粒0.75 g/kg、3 g/kg、12 g/kg,分别于上午8:00~10:00或下午14:00~16:00给药,考察其最佳给药时间;分别给药1 d、7 d、15 d考察其最佳给药疗程。3.3欣梦颗粒镇静催眠作用药物耐受性观察采用小鼠自主活动、阈下剂量和阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠实验,分别给药15 d、30 d、45 d、60 d考察其药物耐受性。3.4欣梦颗粒镇静催眠作用机制研究采用ELISA检测正常小鼠给予7 d欣梦颗粒(0.75 g/kg、3 g/kg、12 g/kg)后大脑中睡眠相关物质神经递质NE、DA、GABA、Ach、5-HT及其代谢物5-HIAA的含量变化。并观察三种GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱、氟马西尼、印防己毒素,对欣梦颗粒协同戊巴比妥钠所致小鼠睡眠的抑制效果,验证欣梦颗粒镇静催眠作用的发挥是否依赖于GABA能神经系统。4结果4.1欣梦颗粒主要药效成分的含量测定本试验建立的HPLC色谱条件专属性、精密度、稳定性、重复性、加样回收率良好。测得的4种成分含量分别为原儿茶醛111.67±2.36 mg/kg、斯皮诺素83.02±0.44 mg/kg、阿魏酸27.35±0.68 mg/kg、五味子醇甲265.27±2.29 mg/kg。4.2欣梦颗粒镇静催眠作用研究与空白对照组相比,欣梦颗粒1.5 g/kg组、3 g/kg组、6 g/kg组、12 g/kg组、24 g/kg组小鼠自主活动显著被抑制;6 g/kg组、12 g/kg组、24 g/kg组小鼠入睡率显著增加;各剂量组阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠入睡潜伏期显著缩短;1.5 g/kg组、3 g/kg组、6 g/kg组阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠持续时间显著延长(均P<0.05)。结果综合分析提示:欣梦颗粒6 g/kg对小鼠上述4项镇静催眠作用观察指标都具有显著效果,可作为临床推荐最佳用量。折算人体按70公斤计,欣梦颗粒最佳颗粒剂日用量为48 g。与空白对照组相比,欣梦颗粒上午给药0.75 g/kg、3 g/kg和下午给药3 g/kg、12 g/kg能显著抑制小鼠自主活动;上午或下午给予12 g/kg欣梦颗粒均能显著增加阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠入睡率;上午或下午给予各剂量欣梦颗粒均能缩短阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠入睡潜伏期;均能显著延长阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠持续时间(均P<0.05)。结果综合分析提示:上午8:00~10:00为小鼠最佳给药时间,对应人类患者临床推荐最佳服药时间为睡前20:00~22:00。与空白对照组相比,给予3 g/kg欣梦颗粒1 d、7 d、15 d均能显著抑制小鼠自主活动和缩短戊巴比妥钠所致小鼠入睡潜伏期,给药15 d能显著增加阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠入睡率,给药7 d、15 d均能显著延长戊巴比妥钠所致小鼠睡眠持续时间。3 g/kg欣梦颗粒给药1 d能发挥镇静催眠作用但效果微弱(2个指标显著,2个指标不显著),给药7 d效果稳定(3个指标显著),给药15 d(4个指标显著性增大)最好。结果综合分析提示:小鼠连续给药15 d疗效最佳,推荐临床用药为疗程15 d。4.3欣梦颗粒镇静催眠作用的药物耐受性观察与空白对照组相比,欣梦颗粒3g/kg组、12 g/kg组给药15 d、30 d、45 d、60 d均能显著抑制小鼠自主活动、增加阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠入睡率、缩短阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠入睡潜伏期和延长阈剂量戊巴比妥钠所致小鼠睡眠持续时间。且各用药时间段组上述指标无显著性差异(均P>0.05),没有随用药时间的延长而疗效降低,说明不需要提高用药剂量来维持原有效果,提示欣梦颗粒的镇静催眠作用没有显著药物耐受性。4.4欣梦颗粒镇静催眠作用机制研究与空白对照组相比,欣梦颗粒3 g/kg组、12 g/kg组给药7 d小鼠脑内单胺类神经递质5-HT、NE、DA含量显著减少,5-HIAA含量显著增加,氨基酸类神经递质GABA含量显著减少,胆碱类神经递质Ach含量显著增加(均P<0.05)。提示欣梦颗粒治疗失眠的作用机制与调节脑内睡眠相关神经递质有关。三种GABAA受体拮抗剂印防己毒素1~2 mg/kg、氟马西尼4~8mg/kg、荷包牡丹碱4~8 mg/kg分别使用,对于欣梦颗粒3~12 g/kg给药1 d联合戊巴比妥钠导致小鼠入睡潜伏期的缩短和小鼠睡眠时间的延长,均有抑制作用。结果提示欣梦颗粒协同戊巴比妥钠的催眠作用,能够被GABAA受体拮抗剂所抑制。5结论5.1利用HPLC测定欣梦颗粒主要成分含量分别为:原儿茶醛111.67±2.36 mg/kg、斯皮诺素83.02±0.44 mg/kg、阿魏酸27.35±0.68 mg/kg、五味子醇甲265.27±2.29mg/kg。5.2欣梦颗粒能显著抑制小鼠自主活动、增加阈下剂量戊巴比妥钠所致小鼠入睡率、缩短戊巴比妥钠所致小鼠入睡潜伏期和延长戊巴比妥钠所致小鼠睡眠持续时间,具有显著的镇静催眠作用。其最佳剂量是小鼠6 g/kg/d,人体48 g/d;最佳给药时间是小鼠8:00~10:00,对应人类为20:00~22:00;小鼠连续给药15 d疗效最佳,推荐临床用药为疗程15 d。5.3欣梦颗粒3 g/kg、12g/kg给药15 d、30 d、45 d、60 d,对小鼠的催眠效果与同等剂量比较,没有随用药时间的延长而疗效降低,提示欣梦颗粒的镇静催眠作用没有显著药物耐受性。5.4欣梦颗粒治疗失眠的作用机制是调节脑内睡眠相关物质,可降低5-HT、NE、DA、GABA和升高5-HIAA、Ach。其作用的发挥依赖于GABA能神经系统。