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血栓性疾病严重威胁着人类的健康，血栓形成机制的研究是医学科学领域重大课题之一。von Willebrand因子（vWF）是由巨核细胞、内皮细胞合成的大分子量的具有粘附功能的糖蛋白，在血栓形成过程中发挥着重要作用，它既可与血小板膜糖蛋白（GP）Ⅰb／Ⅸ／Ⅴ、GPⅡb／Ⅲa结合，又可以和胶原结合介导血小板粘附聚集于受损的血管内皮下组织，导致血栓形成。在此过程中胶原-vWF-GPⅠb间的相互作用是血小板活化的早期事件，vWF是血小板与血管壁胶原之间的桥梁分子，因此阻断vWF在此过程中的作用，可以有效地抑制血栓形成。 本文根据胶原-vWF-GPⅠb相互作用的关系，针对vWF分子进行研究。以脐静脉内皮细胞为实验材料，首先应用基因重组技术克隆了vWF主要功能结构域的基因片段，并在原核细胞中表达，观察重组蛋白的生物学功能；再用重组蛋白为抗原免疫小鼠，建立噬菌体抗体库，筛选有特异性阻断血小板粘附、聚集功能的抗体，试图获得性能优越的抗栓制剂。 vWF-A1区是血小板GPⅠb、瑞斯脱霉素（ristocetin）、botrocetin、的结合部位，也有肝素、胶原的结合位点，是vWF发挥生物学功能的重要结构区域。vWF-A3区是胶原的主要结合部位。我们应用RT-PCR方法从人脐静脉内皮细胞中克隆vWF-A1、vWF-A3区基因片段以及vWF-A1／3嵌合体基因。测序证明克隆的基因序列完全正确，然后分别构建了表达载体pQE-31-vWF-A1、pET-20b-vWF-A3以及pET-22b-vWF-A1／3，在大肠杆菌中进行诱导表达，所表达的目的蛋白分别为菌体总蛋白的30％、46.7％、和12.6％。经次氮基三乙酸镍琼脂糖（Ni-NTA agarose）柱纯化后，目的蛋白的纯度均在95％以上。将纯化的重组目的蛋白通过透析复性后进行了生物学功能的研究。重组的vWF-A1（rvWF-A1）具有良好的生物学活性。用流式细胞术检测，证明rvWF-A1可与转染了GPⅠb的CHO-K1细胞和血小板结合，阳性率分别为96.90％与78.60％，表明rvWF-A1具有结合GPⅠb的功能。用血小板聚集仪测定，结果显示：rvWF-A1不能直接引起血小板聚集，但可以抑制ristocetin诱导的人血浆vWF对血小板的聚集作用，其抑制效应呈剂量依赖性，IC50的rvWF-A1浓度为0.56μmol／L，当浓度为1.4μmol／L时抑制率最高达84.70％。上述结果表明在原核细胞中表达的v认下功能结构域研究及其Al区基因工程抗体制备中文摘要四认T一Al区蛋白可竞争性抑制血浆vWF与血小板GPIb的结合，抑制ristocetin诱导的血小板聚集，具有抗血栓形成的应用前景。 大肠杆菌中高效表达的重组v认下一A3蛋白（四认下一A3）复性后，应用胶原结合试验及竞争抑制实验分析抖认下一A3蛋白的生物学活性。四认下一A3与I、m、vi型胶原均有结合活性，但三者间的结合能力有显著差异，卜12，198，p<0.001，其中与m型胶原的结合率最高，I型其次，vi型最低。且能竞争性抑制血浆vWF与胶原结合，抑制率为54%。这些结果表明四认下一A3具有良好的生物学功能，可作为阻断剂用于干预v认T介导的血小板粘附过程。 重组v认T一Al从3（钾认T一Al从己），四认T一A3经间接免疫荧光标记流式细胞术检测，其结果显示八认TAI/A3嵌合体与血小板的结合阳性率为70.4%，卿认下一A3不能与血小板结合，进一步表明v认T与血小板糖蛋白GPIb江X的结合部位位于Al区。四认T Al/A3嵌合体不能引起血小板的聚集，但即认T Al/A3嵌合体与血小板孵育后可以阻断rist。。就in诱导人血浆v认T对血小板的聚集作用，而且呈剂量依赖性，ICS。的四认T一AI从3浓度为。.76 pmo比，当浓度为1 .17pm。比时抑制率最高达76.8%。ELISA胶原结合试验结果表明，四认T一AI/A3可以和I、m、vi型胶原结合，但三者间的结合率有显著的统计学差异，F=n .259，p<0.001，其中与m型胶原的结合率最高，其次是I型，vi型最低;同时它可以竞争性地抑制v认下与m型胶原的结合，抑制率为76%。表明rvWF一AI从3具有W认T一Al和rvWF一A3双重功能，可同时阻断v从T与GPIb、胶原的结合，具有较好的应用前景。 自从抗GPD七江lla单克隆抗体7E3获得FDA批准应用于缺血性心脏患者的临床治疗、PTCA术后再梗塞的预防，取得了满意的疗效，抗血栓抗体药物的研制已成为该领域的研究热点。由于v认下与GPIb.L尺.V受体的结合是启动血小板粘附、聚集并进而导致血栓形成的首要环节，因此针对v认下与GPIb结合区域的抗体有可能具有抑制血小板的粘附、聚集和血栓形成的作用。为了降低完整抗体的免疫原性和副作用，本研究应用噬菌体展示技术构建抗人v认T一Al的全套单链抗体噬菌体表面展示文库，从中筛选与v认下一Al高亲合力的单链抗体，该技术是将外源蛋白通过与噬菌体外壳蛋白融合表达在噬菌体颗粒表面，将特定分子的基因型和表现型统一在一个噬菌体内，通过反复的“panning”过程，筛选出有高vw万.功能结构域研究及其Al区基因工程抗体制备中文摘要亲合力的单链抗体，这不仅扩大了筛选容量，同时也避免了传统的杂交瘤技术的细胞融合过程，还克服了杂交瘤细胞分泌抗体不稳定的缺点。因此，该技术很快便得到广泛应用，为研制基因工程抗体提供了高效快捷的技术手段