论文部分内容阅读
研究背景：长链非编码RNA (Long non-coding RNA, lncRNA;转录本长度200nt-10Kb)最初被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物,并不具有任何生物学功能。但最近的研究表明,在多种肿瘤中都存在着lncRNA的异常表达,并且与肿瘤的生物学行为及预后密切相关。然而相对于目前筛查出的数万条lncRNA而言,已经鉴定出功能和作用机制的lncRNA仅占很小一部分。膀胱癌中lncRNA的表达情况及其可能的作用机制目前仍不清楚。目的：阐明膀胱癌中lncRNA的表达情况及其可能的作用机制。方法：1.选取膀胱尿路上皮癌及配对的癌旁组织5对,通过Array star公司的lncRNA芯片进行膀胱癌中lncRNA的表达谱研究。2.通过生物信息学分析筛选出差异表达的lncRNA和mRNA,并进行基因功能分析和信号通路分析,最后构建基因共表达网络。3.在差异表达最明显的LncRNAs中随机选择4条(TNXA, CTA-134P22.2, CTC-276P9.1和KRT19P3),通过qRT-PCR在50对癌和癌旁组织中进行验证。4.从筛选出的差异表达表达的lncRNA中选出LOC572558进行后续的功能实验。我们首先构建了过表达LOC572558的膀胱癌细胞稳转株,接下来通过CCK-8实验检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,划痕实验和Transwell实验检测迁移和侵袭,来探讨过表达LOC572558对膀胱癌细胞生物学行为的影响。5.通过磷酸化蛋白芯片和western-blot检测并验证过表达LOC572558后多条信号通路中蛋白磷酸化水平的变化,并通过生物信息学分析总结LOC572558是通过哪些信号通路中的关键蛋白发挥其调控作用的。结果：1.我们发现了3324条差异表达的LncRNA(在癌和癌旁组织差异表达2倍以上),其中明显表达差异的LncRNA为110条(差异表达8倍以上),包括88条表达下调和22条表达上调的LncRNA。2.通过生物信息学分析我们发现这些异常表达的LncRNA可能与膀胱癌的发生和进展有关,其功能可能是通过调控P53、细胞周期或者PPAR信号通路中的蛋白而实现的。3.过表达LOC572558可以抑制膀胱癌细胞的增殖,诱导发生晚期凋亡为主的凋亡,抑制膀胱癌细胞的侵袭和迁移,并使细胞周期阻滞于S期。4.以15%为cutoff值,我们通过蛋白磷酸化芯片发现过表达LOC572558可以上调38个蛋白以及下调61个的蛋白磷酸化水平。生物信息学分析和Western-blot验证表明p53和CREB是LOC572558发挥调控作用的关键基因。结论：膀胱癌中存在广泛的lncRNA的异常表达,可能与膀胱癌的发生及进展相关。在膀胱癌中,LOC572558通过上调p53及下调CREB发挥抑癌基因的作用。它可能成为未来膀胱癌治疗的靶点之一。