癫癎(Epilepsy, EP)是多种病因引起的综合征,是神经系统常见病、多发病之一。癫癎主要靠药物治疗,抗癫癎药物对认知功能的影响目前倍受重视,为进一步了解抗癫癎药物对认知功能影响的程度和造成损害的原因,进行下述系列研究。目的确定常用抗癫癎药物对认知功能的影响;了解抗癫癎药物是否造成海马神经元的凋亡;探讨海马神经元凋亡基因表达的变化。方法1药物:选用常用的苯妥英钠、丙戊酸钠、卡马西平、托吡酯、拉莫三嗪五种药物。2动物:选择60天龄健康雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠为研究对象,共105只,随机分为7个组,每组15只。3癫癎动物模型的制备:将上述7组SD大鼠随机分为正常对照组(NS组)、癫癎未治疗组(PTZ组)、丙戊酸钠治疗组、苯妥英钠治疗组、卡马西平治疗组、托吡酯治疗组及拉莫三嗪治疗组。正常对照组每天腹腔注射生理盐水,其余6组每天腹腔注射戊四氮35mg/㎏点燃。4动物点燃后的处理:6组SD大鼠点燃后,随机分为不干预和5种药物处理组。此后每天腹腔注射PTZ,但5个药物处理组在每天注射PTZ后30分钟经口腔灌注不同的AEDs,剂量为人均量/㎏的25倍。PTZ组30分钟后灌注生理盐水。NS组每天注射与PTZ组等量的生理盐水,灌注生理盐水。持续3周。5认知功能检测:3周后让所有大鼠分别进行水迷宫测试,记录每只大鼠成功次数、游完6次×4天次所用的时间,以NS组和PTZ组为对照,观察有无差异。6 TUNEL法原位标记DNA片段检测凋亡的神经元6.1脑组织标本切片的制作方法:①每组各随机选取大鼠5只,用10%水合氯醛(0.36ml/100g)腹腔注射麻醉,剪开胸腔,从心尖处插入圆头针,同时从右心耳处剪开心脏放血。大鼠在同时间点先后灌注0.9%生理盐水200ml冲洗和4%多聚甲醛磷酸缓冲液250ml固定。灌注完毕后立即断头,迅速取出双侧海马,4%的多聚甲醛固定,常规梯度乙醇脱水,二甲苯透明,浸腊,包埋,选取海马、齿状回互包平面行连续冠状切片,片厚5μm,选取CA1、CA3区连续切片备用。②石蜡包埋的切片再经脱蜡至水,用蛋白酶K液37℃孵育30min,PBS冲洗2次;滴加50μl的TUNEL反应混合液,在湿盒中37℃孵育60min,PBS冲洗3次。DAB暗环境下显色。③切片经过梯度酒精脱水干燥,二甲苯透明,中性树胶封固。6.2 TUNEL法检测阳性表达细胞:在光镜下观察海马CA1、CA3区及齿状回神经元,400倍下选择5个具有代表性的视野,计数阳性细胞数和阴性细胞数,并计算阳性表达百分率[阳性表达百分率=阳性细胞数/ (阳性细胞数+阴性细胞数)×100%],计算平均值。7流式细胞学分析7.1取材:随机取每组大鼠各5只,快速断头取脑,预冷三蒸水洗去血渍,去除脑外膜。7.2单细胞悬液的制备:将新鲜的海马组织放在120目不锈钢网上,下置一平皿,用眼科剪刀将组织剪碎,用眼科镊子轻轻搓组织块,边搓边用生理盐水冲洗,直至将组织搓完为止。将平皿中的混悬液用300目铜网过滤去除细胞团块,收集细胞悬液,以500~800转离心沉淀2分钟。7.3细胞的免疫荧光标记:取单细胞悬液1×106/ml,加入鼠抗人单克隆抗体工作液0.1ml[美国ZYMED试剂公司;生产克隆号:Bcl-2货号:SC-7382, Mouse anti-Bcl-2(C-2)细胞系,Lot:a 1805;Bax货号:SC-7480,Mouse anti-Bax(B-9)细胞系,Lot:l 1004],室温孵育30分钟,洗涤一次,弃上清,加入羊抗鼠FITC-IgG二抗工作液100μl,避光室温孵育30分钟,加入PBS 10ml离心同上,弃上清以除去未结合的荧光二抗,上机检测前加入PBS 0.1ml经500目铜网过滤后上机检测。在对蛋白免疫荧光标记物测定时,设二抗的本底对照和阴性对照。8 sqRT-PCR分析bcl-2,bax表达量目的基因引物的合成:引物序列依据文献报道设计,由上海生物工程公司合成。8.1大鼠bcl-2 RT-PCR实验流程取材:分别于治疗后15d,各组选取5只大鼠,断头处死,冰盘上快速使用200℃干烤的器械于手术台上留取100mg海马组织,迅速将组织置于4℃DEPC水中洗去血液后,置冻存管中保存于液氮中。然后进行组织总RNA提取、提取RNA的完整性检测、提取RNA的定量、cDNA第一链合成、目的基因的PCR扩增和RT-PCR产物半定量等一系列检测,用凝胶图像分析系统(Gel-Pro Analyzer Version 3.0)分析结果。同时扩增鼠β-a?ctin用作内参照,保证每次实验的相对可比性,扩增的目的片段长度为375bp。8.2大鼠bax RT-PCR实验流程:步骤及分析方法同上(bcl-2)。9统计学处理应用SPSS 11.0软件进行统计学分析,数据用均数±标准差(x±s)表示,采用χ2检验、方差分析(ANOVA,F检验)、q检验(New-man-Keuls法)比较。阳性率的比较采用χ2检验。α= 0.05,P < 0.05认为差异有显著性,有统计学意义。结果1认知功能1.1各组完成每次测试所用时间均数差异的两两比较在不同的次别中,托吡酯组与其他6组之间均数差异有显著性(P<0.05),托吡酯组耗时在某次高于其他1组或所有组。其余各组差异无显著性(P>0.05)。1.2各组每天测试所用时间均数差异的两两比较第1天,托吡酯组高于拉莫三嗪组,均数存在差异(P<0.05)。第2天,托吡酯组高于丙戊酸钠组、拉莫三嗪组,均数存在差异(P<0.05)。第3天,托吡酯组高于PTZ组、拉莫三嗪组,均数存在差异(P<0.05)。第4天,托吡酯组高于卡马西平组、丙戊酸钠组、拉莫三嗪组,均数存在差异(P<0.05)。其余各组差异无显著性(P>0.05)。1.3各组完6次测试时间总均数差异的两两比较托吡酯组用时长于其他6组(P<0.01)。拉莫三嗪组短于其他6组(与丙戊酸钠组、卡马西平组比较,P<0.05;与其他组比较,P<0.01)。苯妥英钠组长于NS组、丙戊酸钠组、卡马西平组(P<0.05)和拉莫三嗪组(P<0.01);短于托吡酯组(P<0.01)。其余各组间差异无显著性(P>0.05)。1.4短期学习与记忆功能测试成绩提高状况苯妥英钠组成绩提高较慢,第1次与第4、6次之间存在差异(P<0.05)。托吡酯组很慢,各次之间差异无统计学意义(P>0.05)。其余各组成绩提高均快(P<0.05, P<0.01)。1.5中期学习与记忆功能测试成绩提高状况托吡酯组:4天之间差异无显著性(P>0.05)。拉莫三嗪组:第1天与第2天(P<0.05)、第3、4天(P<0.01)以及第2天与第3、4天(P<0.05)之间差异有显著性。其余各组介于此两组之间(P<0.05,P<0.01)。1.6各组之间定向寻找平台象限时间的比较托吡酯组所需时间明显多于其他6组(P<0.01)。其余各组差异无统计学意义(P>0.05)。1.7各组之间定向逗留平台象限时间的比较托吡酯组与卡马西平组(P<0.05)、拉莫三嗪组(P<0.01)均数存在差异。其余各组差异无显著性(P>0.05)。1.8测试成绩提高状况PTZ组学习成绩提高快(P<0.05,P<0.01)。卡马西平组、丙戊酸钠组、拉莫三嗪组测试成绩提高很快(P<0.01),优于NS组。苯妥英钠组测试成绩提高较慢(P<0.05),与NS组比较无明显差异。托吡酯组测试成绩提高慢,各次、各天之间差异无显著性(P>0.05),较NS组差。2 TUNEL结果2.1 PTZ及抗癫癎药物对大鼠海马CA1区神经元TUNEL阳性表达的影响生理盐水组阳性率2.79%,PTZ组阳性率3.72%,卡马西平组阳性率5.70%,丙戊酸钠组阳性率3.56%,4组之间差异无显著性(X2=3.59, P>0.05)。苯妥英钠组阳性率33.68%,托吡酯组阳性率35.79%,拉莫三嗪组阳性率34.02%,三组之间差异无显著性(X2=0.32, P>0.05)。生理盐水组、PTZ组、卡马西平组、丙戊酸钠组与苯妥英钠组、托吡酯组、拉莫三嗪组之间差异有显著性(X2=329, P<0.005)。2.2 PTZ及抗癫癎药物对大鼠海马CA3区神经元TUNEL阳性表达的影响生理盐水组阳性率2.31%,PTZ组阳性率2.97%,卡马西平组阳性率3.66%,丙戊酸钠组阳性率2.61%,4组之间差异无显著性(X2=7.70, P>0.05);苯妥英钠组阳性率25.2%,托吡酯组阳性率30.16%,拉莫三嗪组阳性率30.15%,三组之间差异无显著性(X2=2.03, P>0.05)。生理盐水组、PTZ组、卡马西平组、丙戊酸钠组与苯妥英钠组、托吡酯组、拉莫三嗪组之间差异有显著性(X2=253.43, P<0.005)。2.3 PTZ及抗癫癎药物对大鼠海马齿状回神经元TUNEL阳性表达的影响生理盐水组阳性率3.41%,PTZ组阳性率4.01%,卡马西平组阳性率4.42%,丙戊酸钠组阳性率2.52%,4组之间差异无显著性(X2=1.683, P>0.05)。苯妥英钠组阳性率30.58%,托吡酯组阳性率32.98%,拉莫三嗪组阳性率29.35%,三组之间差异无显著性(X2=0.892, P>0.05)。生理盐水组、PTZ组、卡马西平组、丙戊酸钠组与苯妥英钠组、托吡酯组、拉莫三嗪组之间差异有显著性(X2=287.092, P<0.005)。3 FCM结果3.1 PTZ及抗癫癎药物对大鼠海马神经元Bcl-2表达的影响3.1.1 Bcl-2表达差异的比较生理盐水组低于苯妥英钠组(q=4.887,P<0.05)、托吡酯组(q=3.858,P<0.05)、拉莫三嗪组(q=3.734, P<0.05),差异有显著性;苯妥英钠组高于PTZ组(q=3.399,P<0.05)差异有显著性;其他各组之间差异无显著性(P>0.05)。3.1.2 Bcl-2线性表达差异的比较生理盐水组低于苯妥英钠组(q=4.887,P<0.05)、卡马西平组(q=3.650,P<0.05)、拉莫三嗪组(q=3.724,P<0.05),差异有显著性;苯妥英钠组高于PTZ组(q=3.146, P<0.05),差异有显著性;其他各组之间差异无显著性(P>0.05)。3.1.3 Bcl-2荧光指数表达差异的比较苯妥英钠组高于PTZ组(q=2.542,P<0.05)、丙戊酸钠组(q=2.657,P<0.05),差异有显著性,其他各组之间差异无显著性(P>0.05)。3.2 PTZ及抗癫癎药物治疗对大鼠海马神经元Bax表达的影响3.2.1 Bax表达差异的比较托吡酯组高于PTZ组(q=3.241,P<0.05)、卡马西平组(q=3.477,P<0.05),差异有显著性;其他各组之间差异无显著性(P>0.05)。3.2.2 Bax线性表达差异的比较各组之间差异无显著性(F=0.471,P>0.05)。3.2.3 Bax荧光指数表达差异的比较各组之间差异无显著性(F=0.516,P>0.05)。3.3 PTZ及抗癫癎药物对大鼠海马神经元Bcl-2及Bax表达比值的影响3.3.1 Bcl-2/Bax比值的比较生理盐水组低于苯妥英钠组(q=6.464,P<0.05)、卡马西平组(q=5.625,P<0.05)、拉莫三嗪组(q=3.701, P<0.05),差异有显著性;苯妥英钠组高于丙戊酸钠组(q=3.395,P<0.05)、托吡酯组(q=4.259,P<0.05),差异有显著性;卡马西平组高于托吡酯组(q=4.259,P<0.05),差异有显著性;其他各组之间差异无显著性(P>0.05)。3.3.2 Bcl-2/Bax线性比值的比较苯妥英钠组高于生理盐水组(q=6.576,P<0.05)、PTZ组(q=3.588, P<0.05)、卡马西平组(q=3.394, P<0.05)、丙戊酸钠组(q=5.955,P<0.05)、托吡酯组(q=5.270,P<0.05)、拉莫三嗪组(q=3.494,P<0.05),差异有显著性;其他各组之间差异无显著性(P>0.05)。3.3.3 Bcl-2/Bax荧光指数的比较苯妥英钠组高于PTZ组(q=3.465,P<0.05)、卡马西平组(q=3.277, P<0.05)、丙戊酸钠组(q=5.750,P<0.05)、托吡酯组(q=5.088,P<0.05)、拉莫三嗪组(q=3.374, P<0.05),差异有显著性;其他各组之间差异无显著性(P>0.05)。4 RT-PCR结果4.1 bcl-2表达:各组之间bcl-2表达及bcl-2/β-actin比值的差异无显著性(F=0.312,F=0.199,P>0.05)。4.2 bax表达:各组之间bax表达的差异无显著性(F=0.792,P>0.05)。各组之间bax/β-actin比值的差异有显著性(F=1.943,P<0.05),NS组与苯妥英钠组(q=3.469,P<0.05)、丙戊酸钠组(q=3.420,P<0.05)之间差异有显著性;其他各组之间差异无显著性(P>0.05)。4.3 PTZ诱导癫癎发作及抗癫癎药物治疗对大鼠海马神经元bcl-2及bax表达比值的影响:各组之间bcl-2/bax及bax/ bcl-2比值的差异无显著性(F=0.652,F=1.756,P>0.05)。结论1抗癫癎药物对认知功能有一定影响,有些提高认知功能,有些损害认知功能。托吡酯、苯妥英钠损害认知功能,托吡酯还可损害大鼠的记忆功能,降低大鼠的反应状态。丙戊酸钠、卡马西平、拉莫三嗪对大鼠学习记忆功能有改善作用,反应良好。PTZ对大鼠认知功能无不良影响。2癫癎经苯妥英钠、托吡酯及拉莫三嗪药物治疗后,海马区存在TUNEL染色阳性细胞;TUNEL染色阳性细胞大部分是神经元,一部分是神经胶质细胞。PTZ点燃组、生理盐水对照组、卡马西平组及丙戊酸钠组海马区神经元和神经胶质细胞TUNEL阳性表达率很低,4组相比差异无显著性(P>0.05)。3某些抗癫癎药物通过影响Bcl-2、Bax表达引起海马神经元凋亡。PTZ点燃癫癎发作经苯妥英钠、卡马西平、拉莫三嗪治疗后海马神经元Bcl-2表达上调,与生理盐水对照组相比,差异有显著性(P<0.05)。Bax表达下调,与生理盐水对照组相比,差异无显著性(P>0.05)。Bcl-2/Bax比值高于生理盐水对照组,差异有显著性(P<0.05)。PTZ点燃癫癎发作经丙戊酸钠、托吡酯治疗后海马神经元Bcl-2表达上调,与生理盐水对照组相比,差异无显著性(P>0.05)。Bax表达下调,与生理盐水对照组相比,差异无显著性(P>0.05)。Bcl-2/Bax比值与生理盐水对照组相比,差异无显著性(P>0.05)。4 PTZ点燃癫癎发作经治疗后各组海马神经元bcl-2表达增加及bcl-2/β-actin比值增大,但与生理盐水组相比,差异无显著性(P>0.05)。各组之间bcl-2/bax比值差异无显著性(P>0.05)。海马神经元bax表达有差异,丙戊酸钠组与生理盐水对照组相比降低差异有显著性(P<0.05)。各组bax/β-actin表达有差异,苯妥英钠组、丙戊酸钠组与生理盐水对照组相比降低差异有显著性(P<0.05)。其余各组之间差异无显著性(P>0.05)。海马神经元bcl-2、bax表达量虽有不同,但大部分与生理盐水对照组相比差异无显著性,原因可能为抗癫癎药物不足以引起凋亡基因在短时间的大量表达。