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磷在植物生长发育过程中起着非常重要的作用。前期研究发现,草莓果实中磷含量与糖含量呈显著正相关。自然界中可供植物吸收利用的无机磷含量较低,施用磷肥可以提高草莓品质,但是生产和过量施用磷肥都会对生态环境产生负面影响,因此,揭示草莓磷吸收和体内平衡机理并在此基础上培育磷高效利用品种具有重要意义。本研究以二倍体森林草莓‘Ruegen’为试材,克隆草莓FvPHR1和FvPHO2基因,通过稳定遗传转化明确FvPHR1、microRNA399a(miR399a)和FvPHO2在草莓植株中的功能,揭示草莓植株中FvPHR1、FvmiR399a和FvPHO2之间的调控机理。主要研究内容如下:1.从森林草莓‘Ruegen’中,克隆FvPHR1基因,其基因编码区全长为1542 bp,编码513个氨基酸。通过将FvPHR1与拟南芥和水稻PHR1氨基酸序列比对,表明FvPHR1属于MYB-CC家族,包括两个保守结构域MYB和CC结构域;将重组质粒pAN580-FvPHR1GFP转化到水稻原生质体,通过在激光共聚焦显微镜下观察显示FvPHR1-GFP融合蛋白定位在细胞核中,表明FvPHR1是核蛋白;将重组质粒pGBKT7-FvPHR1转化到酵母菌中,通过观察其在SD/-Trp和SD/-Trp-His-Ade的培养基中的生长情况,明确FvPHR1具有转录激活活性;在双分子荧光互补试验中,将含有重组质粒eYNE-FvPHR1和eYCE-FvPHR1的农杆菌注射到烟草中,在激光共聚焦显微镜下观察发现细胞核中出现强烈的荧光信号,表明FvPHR1在细胞核中能形成同源二聚体,这些结果证明FvPHR1是一个转录因子。2.利用农杆菌介导的叶盘法将FvPHR1的过表达载体pRI101-FvPHR1导入森林草莓‘Ruegen’中,得到3个过表达FvPHR1的草莓株系。通过对磷含量的检测,表明FvPHR1过表达草莓植株叶片中磷含量与对照相比增加了1.38-1.78倍。3.首先对所获得的3个miR399a过表达草莓株系进行鉴定,并通过对miR399a的过表达和对照植株观察表型并统计分析,表明miR399a过表达植株的叶面积、冠径和净光合速率明显高于对照,而miR399a过表达植株的株高与对照植株相比没有明显差异。接下来,通过对miR399a的过表达和对照植株磷含量的检测,表明miR399a过表达植株叶片和果实中磷含量是对照的1.1-2.1倍。然而,miR399a过表达植株根中磷含量下降了25%到45%。通过对miR399a过表达草莓植株主根长度的观察,发现在高磷和低磷条件下,miR399a过表达植株的主根长度与对照相比分别短了35-41%和18-33%。4.通过对miR399a过表达和对照植株的草莓品质评价指标的测定,揭示miR399a的过表达增加了草莓果实中总糖、可溶性固形物和维生素C的含量。通过高效液相色谱法(HPLC)对miR399a过表达和对照的草莓果实中果糖、葡萄糖和蔗糖含量的检测,表明miR399a过表达草莓果实中糖含量的增加是由于果糖和葡萄糖组分含量的增加所导致。5.从森林草莓‘Ruegen’中,克隆FvPHO2基因,其基因编码区全长为2790 bp,编码929个氨基酸。通过将草莓FvPHO2与拟南芥、苹果和梅中PHO2氨基酸序列比对,表明草莓FvPHO2和其他物种中PHO2氨基酸序列均含有保守的UBCc结构域。暗示FvPHO2可能是一个E2泛素结合酶。利用qRT-PCR的方法检测FvPHO2在森林草莓‘Ruegen’不同器官中的相对表达量,结果表明FvPHO2基因在这些器官中均有表达,其中在根中表达量最高,在叶片中的表达量较低。6.通过构建FvPHO2的过表达载体pRI101-FvPHO2、FvPHO2的沉默表达载体pRNAi-FvPHO2和分别携带两个sgRNA的CRISPR/cas9基因组编辑的载体,两个sgRNA分别选自于FvPHO2的第一个内含子和UBCc结构域的区域内。利用农杆菌介导的森林草莓稳定遗传转化的方法将以上载体分别导入森林草莓‘Ruegen’中,得到3个FvPHO2过表达的草莓转基因株系,3个FvPHO2基因沉默的草莓转基因株系。同时也获得4个突变sgRNA1靶位点的株系且四株均为纯合突变体,和4个突变sgRNA2靶位点的株系且均为杂合突变体。通过对FvPHO2基因编辑植株中磷含量的检测,揭示FvPHO2基因编辑使草莓植株中磷含量增加。这暗示在草莓植株中FvPHO2是磷吸收和转运的负调控因子。7.通过克隆并分析草莓MIR399a基因启动子序列发现在FvMIR399a基因的启动子中有4个PHR1结合位点(P1BS:GNATATNC)。酵母单杂和凝胶迁移试验发现FvPHR1能够直接绑定MIR399a启动子中P1BS-3和P1BS-4顺式作用元件。并且在FvPHR1过表达草莓植株中发现miR399a的表达量显著上调,表明在草莓体内FvPHR1能够正向调控miR399a的表达。8.通过对FvPHO2的5’UTR序列中miR399a靶位点的预测分析和5’RLM-RACE试验表明,miR399a能切割FvPHO2基因。并且在miR399a过表达草莓植株中FvPHO2的表达量明显下调,表明草莓中FvPHO2是miR399a的靶基因。本研究明确了FvPHR1-miR399a-FvPHO2对草莓植株磷信号有调控作用,发现miR399a的过表达能提高草莓果实糖含量,这些结果不仅为阐明草莓磷信号的分子调控机制奠定了基础,也为培育磷高效利用的高糖草莓品种提供了理论依据。