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肺癌是目前世界上导致肿瘤相关死亡的最常见病因,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)在肺癌中占绝大部分。尽管化疗、放疗方案不断发展,针对不同基因突变类型的分子靶向药物也不断推出,NSCLC患者的预后仍不容乐观,5年生存率几乎低于15%,新的治疗方法亟待研发。肿瘤作为一种慢性的、多基因、炎症促进性疾病,其产生及进展的机制十分复杂。越来越多的证据表明,肿瘤的生长伴随着特殊的肿瘤微环境形成,并且能通过若干方法来逃避免疫监视、打乱免疫调定点,从而躲避机体免疫系统的消灭。肿瘤本身包含许的基因和表观的改变,这些改变能够产生可能被免疫系统识别的肿瘤抗原,从而触发机体的T细胞免疫应答。无论肿瘤在什么部位,免疫系统T细胞首先识别肿瘤细胞作为非正常组织,然后产生大量的能移动并侵入肿瘤的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL),从而特异性的结合并杀死肿瘤细胞。在正常组织中,免疫调定点之间存在着一种平衡,使T细胞免疫反应保持在合适的强度和范围内,从而能够最小程度地损害正常组织避免自身免疫性疾病的发生。然而,肿瘤能够利用许多通路上调穿过细胞表面的分子的负向调控信号,从而抑制T细胞活性或者诱导其凋亡进而促进肿瘤进展和转移。越来越多的基础和临床试验表明利用抗体阻断调定点通路的免疫治疗方法,能够恢复机体的肿瘤抑制和促进抗肿瘤活性,从而达到治疗肿瘤的目的。近年来,通过对肿瘤免疫耐受和逃逸机制的广泛而深入的研究发现,参与机体免疫调节的协同刺激分子的表达异常在肿瘤的免疫逃逸中扮演着重要角色。近几年,CD28/B7协同刺激分子家族成员不断扩大,程序性死亡因子1(programmed death-1,PD-1)及其配体程序性死亡因子1配体1(programmed death ligand-1,PD-L1)作为C D28/B7协同刺激分子超家族的新成员,可以介导负性协同刺激信号,能有效抑制T、B细胞的功能和增殖,同时减少细胞因子IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌,该抑制途径参与的免疫调节在肿瘤免疫逃逸、肿瘤微环境形成中起到了重要的作用,和肿瘤的发生和发展密切相关。阻断PD-1/PD-L1通路能够抑制肿瘤微环境的形成并且增强内源性的抗肿瘤免疫应答。目前处于临床试验阶段的PD-1/PD-L1抑制剂有很多,具体的实验方案也不尽相同,很多问题处于探索阶段。不过在2015年3月,PD-1抑制剂nivolumab已经率先被FDA批准为治疗在经铂为基础化疗期间或化疗后发生疾病进展的转移性鳞性非小细胞肺癌。有研究显示,肿瘤组织中PD-L1的表达或许与NSCLC患者接受免疫治疗的有效性相关,也与NSCLC患者的不良预后和高侵袭性密切相关,但是这个观点目前仍存在一些争论。随着研究的不断深入,协同刺激分子已经被证实能够分别以细胞膜型和可溶性分子两种形式存在。据临床研究显示,许多可溶性协同刺激分子的表达水平同样具有诊断或疾病预后判断的价值,而且其可溶性的特点也便于临床应用。目前,因缺乏统一有效的检测方法,国内外对可溶性PD-1、PD-L1(s PD-1、s PD-L1)的研究报道较少,其在健康人机体内以及肿瘤患者尤其是肺癌患者体内表达水平是否存在有统计学意义的差异,其生物学意义在临床应用前景如何尚无深入研究,值得进一步探讨。因此在NSCLC患者体内,s PD-1、s PD-L1的表达水平如何?这两种可溶性协同刺激分子与其细胞模型分子的表达强度之间有什么样的关系,与患者临床特征和预后有什么样的关系,PD-1/PD-L1通路与其他小分子蛋白之间的关系?为解答这一系列问题,我们设计了该研究,包括三部分内容:第一部分:用酶联免疫吸附试验方法检测(Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)88例可手术NSCLC患者术前血浆中s PD-1和s PD-L1的表达水平,同时以40名健康志愿者的表达水平为对照。单独或联合分析这些指标与患者临床病理特征和预后的关系。结果显示:血浆s PD-1和s PD-L1表达水平显著高于健康志愿者。生存分析结果表明s PD-L1血浆含量、s PD-L1/s PD-1的比值对患者的生存情况具有显著影响,是患者的独立预后因素:s PD-L1>3.4ng/m L的患者的OS为61.73个月,明显高于s PD-L1≤3.4ng/m L时患者的45.87个月;s PD-L1/s PD-1比值>1.7925时,患者的平均OS为65.10个月,明显高于比值低者的54.44个月。第二部分:应用免疫组化方法(Immunohistochemistry,IHC)检测217例可手术的NSCLC患者术后肿瘤组织中肿瘤细胞以及肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes,TILs)中PD-1和PD-L1的表达水平,采用多种统计方法对结果进行统计,并单独和联合分析这些指标与患者临床病理特征和预后的关系。结果显示:两者均表达于细胞浆和细胞膜,肿瘤组织中癌细胞的PD-L1的表达水平与NSCLC患者的性别和组织病理学类型有关,TILs的PD-L1表达水平与肿瘤的分化程度相关;肿瘤组织中癌细胞的PD-1表达水平与肿瘤的组织病理学类型和分化程度有关;TILs的PD-1表达水平与患者的性别、组织学类型以及肿瘤的直径相关。肿瘤组织中癌细胞的PD-L1表达水平与癌细胞的PD-1表达水平呈正相关;肿瘤组织中癌细胞的PD-L1表达水平与肿瘤组织中TILs的PD-L1表达水平有显著正相关关系;肿瘤组织中TILs的PD-L1表达水平与TILs的PD-1表达水平有显著正相关关系。NSCLC患者肿瘤组织中癌细胞和TILs的PD-1、PD-L1表达水平在独立和联合分析时均与NSCLC患者的预后无关。第三部分:针对淋巴结转移阳性的患者,应用IHC方法检测了同一患者术后肿瘤组织及其转移淋巴结中的肿瘤细胞以及TILs中PD-1和PD-L1的表达水平,对结果进行统计分析,验证两者之间是否存在一致性。PD-1和PD-L1的表达水平受很多其他蛋白因子的影响,本课题通过IHC和ELISA两种方法分别检测了VEGF-C在肿瘤组织和血浆中的含量,分析其表达水平与PD-1和PD-L1之间的关系。结果显示:同一患者术后肿瘤组织及其转移淋巴结中的肿瘤细胞以及TILs中,对应转移淋巴结标本内TILs的PD-L1表达水平与肿瘤组织标本中TILs的PD-L1表达水平有显著正相关关系。肿瘤组织中VEGF-C的表达情况与患者的组织类型有关:腺癌的VEGF-C免疫组化得分明显低于鳞癌;血浆中VEGF-C的含量是NSCLC患者预后相关的独立因素。NSCLC患者血浆中PD-L1含量与VEGF-C的含量呈负相关;血浆中PD-1含量与癌组织PD-1表达水平呈负相关;癌组织PD-L1表达水平与VEGF-C的血浆含量呈负相关;TILs的PD-L1、PD-1表达水平均与VEGF-C的血浆含量呈负相关;TILs的PD-L1表达水平与VEGF-C免疫组化得分呈正相关。本文发现与健康志愿者相比,NSCLC患者血浆中PD-L1和PD-1的表达水平失衡,即二者比值增加,并且生存分析提示该比值增加为患者的不良预后因素。因此检测患者外周血和肿瘤组织中的PD-1和PD-L1表达情况,不仅为预后评估、风险分层等诸多方面提供信息,也为个体化的免疫治疗拓宽了思考方向。