背景和目的：　　 牙髓病治疗的生物学原则是尽量保留健康牙髓的活力,以利于保持牙髓对牙体硬组织、特别是牙冠的营养,从而降低因牙髓失活而出现牙体硬组织脆性增加的危险性,提高牙齿使用的寿命。目前,在牙髓病治疗领域还没有一种能够保存健康牙髓活力、特别是促进残存牙髓组织再生的有效治疗方法。　　 自体来源富血小板血浆(platelet rich plasma,PRP)含有机体组织生长和修复所必需的多种生长因子,据报道PRP具有促进硬、软组织创伤愈合以及骨组织再生的作用,并且已有研究者将其用于整形外科、口腔种植牙和牙周外科等临床治疗领域。段建民等研究发现:去除PRP中血浆成分后的洗涤血小板(washedplatelet,WPLT)对人牙髓细胞增殖具有明显的促进作用,从而提示将PRP加以改良后用于牙齿活髓保存治疗、甚至牙髓组织再生治疗的可能性。目前由于国内外在对PRP的制备方法、血小板的激活方式、PRP中血小板使用浓度等方面尚无统一的标准,加上PRP中多种生长因子在体内相互协同作用的复杂生物学机制尚不清楚,所以,PRP在临床应用的效果目前还没有得到一致认可,因此,有必要对PRP的制备、激活及临床使用方法做更基础的、系统的研究。　　 本文研究的目的在于,通过对比观察液氮冻融与传统牛凝血酶法激活血小板、促进其释放生长因子的作用效果,以及液氮冻融WPLT与牛凝血酶激活PRP对人牙髓细胞增殖与矿化的作用效果,藉以探讨安全、高效促进血小板释放生长因子的有效方法,以及PRP与改良PRP促进人牙髓细胞增殖与矿化的理想浓度,进而为下一步将自体来源PRP用于牙齿活髓保存和牙髓组织再生治疗的在体实验研究提供必要的实验数据。　　 材料和方法：　　 第一部分液氮冻融与牛凝血酶促进血小板释放生长因子的作用比较　　 1、PRP及WPLT制备方法:抽取5名健康志愿者静脉血,采用二次离心法制备PRP及乏血小板血浆(platelet poor—plasma,PPP),用6mmol/L EDTA/α-MEM洗涤去除PRP中的血浆成分,调整血小板浓度与PRP相同后制成WPLT。　　 2、WPLT采用液氮反复冻融的方法促进其释放生长因子,而PRP采用含31.25u/ml～1000u/ml牛凝血酶的10％氯化钙溶液进行激活。　　 3、ELISA法定量检测WPLT、PRP及PPP中血小板衍生生长因子AA(Platelet-derived growth factor-AA,PDGF-AA)、转化生长因子β1(Transforminggrowth factor-β1,TGF-β1)浓度。　　 第二部分 WPLT与PRP促进同体人牙髓细胞增殖的作用比较　　 1、牙髓细胞的收集和培养　　 取健康志愿者因正畸需要拔除的牙齿,组织块酶消化法原代培养牙髓细胞,酶消化法传代。　　 2、牙髓细胞的观察与细胞来源鉴定　　 观察原代与传代牙髓细胞的形态及生长情况,绘制生长曲线,抗角蛋白、波形丝蛋白免疫组化染色鉴定细胞来源。　　 3、WPLT与PRP对牙髓细胞增殖的作用　　 人牙髓细胞传代培养至第4代后,分别加入同体来源不同浓度液氮冻融激活的WPLT及牛凝血酶激活的PRP,采用细胞定量测定试剂盒MTS法测定细胞增殖情况。　　 第三部分 WPLT与PRP促进同体人牙髓细胞矿化的作用比较　　 1、人牙髓细胞矿化诱导培养　　 取第4代牙髓细胞分别加入同体来源不同浓度冻融激活的WPLT及牛凝血酶激活的PRP以及矿化诱导液,对人牙髓细胞矿化诱导培养7-20天。　　 2、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定　　 牙髓细胞矿化诱导培养7天后用碱性磷酸酶及蛋白定量试剂盒测定人牙髓细胞ALP活性。　　 3、矿化结节形成情况观察　　 茜素红染色观测牙髓细胞在不同培养条件下经矿化诱导10d及20d后的矿化结节形成情况。利用计算机软件计算诱导培养20d后形成的矿化结节面积,然后进行医学统计学处理。　　 结果：　　 1、31.25u/mL～1000u/ml的牛凝血酶均可激活血小板、促进其释放PDGF-AA和TGF-β1,其中,125u/ml～1000u/ml牛凝血酶促进PDGF-AA释放的浓度显著高于31.25u/ml～62.5u/ml牛凝血酶；500u/ml～1000u/ml牛凝血酶促进TGF-β1释放的浓度显著高于31.25u/ml～250u/ml的牛凝血酶。　　 2、液氮冻融促进血小板释放PDGF-AA和TGF-β1的浓度分别为8.973±1.213ng/ml和27.445±2.273ng/ml,与500u/ml～1000u/ml牛凝血酶激活血小板促进其释放PDGF-AA和TGF-β1的浓度比较无显著差异。　　 3、10ml/L～100ml/L液氮冻融激活的WPLT显著促进了同体来源人牙髓细胞的增殖,而且该作用与相同浓度牛凝血酶激活的PRP比较无显著差异,但是,200ml/L的WPLT和PRP促进人牙髓细胞增殖的作用均显著低于100ml/L浓度组。　　 4、100ml/L～300ml/L的WPLT与PRP均显著促进了同体来源人牙髓细胞的ALP活性,其中,以200ml/L浓度尤为显著；100ml/L～300ml/L的WPLT与PRP均显著促进了矿化诱导10d后的人牙髓细胞矿化结节形成,其中,100ml/L浓度在矿化诱导20d后促进人牙髓细胞形成的矿化结节最大。但是,相同浓度的WPLT与PRP之间在作用效果上没有显著差异。　　 结论：　　 1、液氮冻融作为一种安全、有效的血小板激活方式可以替代目前使用的牛凝血酶。　　 2、液氮冻融激活的WPLT与牛凝血酶激活的PRP在一定浓度范围(10ml/L～100ml/L)均可以显著促进同体来源人牙髓细胞的增殖,而且两者的作用效果无显著差异。　　 3、100ml/L～300ml/L的WPLT和PRP均可以显著促进同体来源人牙髓细胞的矿化。　　 4、100ml/L可能是WPLT和PRP用于在体牙髓保存实验的理想浓度。