第一部分 Emb基因敲除小鼠的构建及其肠神经系统发育的异常目的:建立可稳定遗传的Emb基因敲除小鼠模型,观察肠神经系统发育的情况。方法:用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Emb基因敲除鼠,通过Western blot和RT-qPCR实验来检测其后代小鼠肠道中Emb基因的mRNA和蛋白的表达情况。从形态学及免疫荧光组织化学的方面研究基因敲除鼠肠神经系统的表型。结果:我们构建了 Emb基因敲除小鼠模型,并通过一系列实验验证了其肠道组织中相应mRNA和蛋白表达量的减少。我们发现Emb基因敲除鼠毛色与正常小鼠相同,体重与正常对照组相比并无统计学差异,但繁殖过程中Emb-/-小鼠数量较少,不符合孟德尔遗传定律,存在不完全胚胎致死现象。此外,成年小鼠近端肠道粪便淤积,远端狭窄,出现了巨结肠表型,经免疫荧光Tuj1染色发现小鼠结肠远端肠神经嵴细胞缺失。结论:成功构建Emb基因敲除小鼠模型,并且Emb-/-纯合子小鼠存在巨结肠表型,远端结肠中神经节细胞缺失。第二部分 Emb基因敲除小鼠肠神经嵴细胞体外迁移情况的研究目的:体外组织水平探究Emb基因敲除小鼠肠神经嵴细胞的迁移能力。方法:肠神经嵴细胞滤膜爬行实验,即体外培养胎鼠肠道48h后观察肠神经嵴细胞从肠道向外迁移的情况。结果:Emb-/-纯合子小鼠肠神经嵴细胞迁移出的距离明显小于正常对照组,虽然在距离肠道边缘0～100μm范围内肠神经嵴细胞数目稍多于正常对照组,但是迁移出来的细胞总数与对照组相比,明显减少。而Emb+/-杂合子小鼠与正常对照组的肠神经嵴细胞在迁移距离和数量上并无统计学差异。此外,正常对照组小鼠肠道边缘的肠神经嵴细胞轴突垂直于边缘生长,相互密集交错,而Emb+/-小鼠的轴突偶见倒伏生长,相邻间隔增大,Emb-/-小鼠少见垂直生长的轴突,多数缠绕在肠道的表面。结论:Emb基因是肠神经嵴细胞迁移和轴突生长所必须的。Emb-/-纯合子小鼠肠神经嵴细胞迁移能力障碍,迁移距离和细胞数目均减少,并且轴突生长受限。第三部分Emb基因敲除小鼠肠神经嵴细胞体内迁移速度与方向性的研究目的:构建肠神经嵴细胞特异性表达荧光蛋白的Emb基因敲除小鼠模型,通过延时成像实验探究Emb基因对肠神经嵴细胞迁移速度和方向性的影响。方法:利用Cre-loxp重组酶系统构建Sox10-tdTomato转基因荧光鼠,并与Emb基因敲除小鼠交配使其后代的肠神经嵴细胞特异性表达tdTomato荧光蛋白。使用共聚焦显微镜拍摄E12.5d胎鼠肠道中肠神经嵴细胞迁移的延时成像电影。结果:将Sox 10-CreER小鼠与Rosa-tdTomato小鼠交配,孕鼠注射他莫昔芬后,观察到E12.5d胎鼠肠道强烈表达红色荧光。通过延时成像实验观察了其单个肠神经嵴细胞的迁移速度与方向性。结论:成功构建Sox10-tdTomato转基因荧光鼠,其肠神经嵴细胞特异性表达红色荧光蛋白。由于时间原因尚未得到肠神经嵴细胞特异性表达红色荧光蛋白的Emb基因敲除鼠,但是验证了延时成像实验的可行性。