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该课题主要针对NR主亚基NR1的抗原性、免疫原性及其抗体对兴奋性神经元损伤的保护作用进行充分的研究论证,为兴奋毒性脑损伤免疫干预提供实验基础.主要实验内容如下:一NR1激动剂结合区域片段表位分析;采用生物信息学方法对人NMDAR主亚基NRla上两个受体激活相关多肽片段P1(第一跨膜区前)、P2片段(第三、四跨膜域之间)的理化特性与抗原性进行了分析.二M3M4环靶片段特异性单抗表位分析;为了进一步获得M3M4片段的表位信息,我们以单克隆抗体MAB363(识别表位位于人NR1分子M3M4环)淘筛噬菌体展示随机12肽库,对筛选克隆进行特异性ELISA检测和竞争结合实验分析.三M3M4片段免疫应答检测及抗血清的抗兴奋毒性作用与机制探讨;(一)M3M4片段免疫应答检测;(二)M3M4片段抗血清抗兴奋毒性损害作用;(三)单克隆抗体MAB363抗兴奋毒性损害作用;(四)单克隆抗体MAB363抗兴奋毒作用机制探讨.四抗M3M4单链抗体库的构建与筛选;单抗多为鼠源性,其Fc段是引起人体排异反应的主要部分,我们决定构建鼠源抗NMDAR功能表位的单链抗体(scFv).利用全套噬菌体抗体表面展示技术,从重组人NR1 M3M4环免疫的小鼠脾淋巴细胞中提取总RNA,并纯化出mRNA后反转录成cDNA,用抗体可变区PCR混合引物进行全套抗体重、轻链可变区(VH和VL)基因扩增.综上所述,我们利用生物信息学预测得出NR1主亚基P2片段上存在若干B表位,容易成为免疫干预的靶点;以单抗MAB363筛选噬菌体随机展示肽库,结合表位肽竞争性ELISA分析获得其识别表位,且与生物信息学预测结果吻合,提示该表位可能是NR1膜蛋白M3M4环靶片段上一个重要的B细胞主表位;进一步的动物实验证明M3M4环重组肽具有免疫原性,阳性血清和单抗MAB363具有体外抗兴奋毒作用,其机制可能与抑制钙离子内流、影响细胞内蛋白质二级结构有关;构建抗M3M4重组肽的ScFv抗体库,筛选并获得抗M3M4和表位肽的阳性ScFv抗体.以上工作为免疫干预NMDAR治疗兴奋毒性神经损伤打下了重要基础,相关研究国内外尚未见报道.