论文部分内容阅读
背景及目的:头颈恶性肿瘤是全球范围内的第7大癌症类型,约占全部恶性肿瘤的10%,超过90%的头颈恶性肿瘤为鳞状细胞癌。下咽癌是发生在喉咽的一种少见且起病隐匿的恶性肿瘤,但却是头颈鳞癌中预后最差的一种。顺铂是包括下咽癌在内的头颈鳞癌化疗中最常使用的化疗药物,但顺铂耐药往往容易导致化疗失败。寻找一个下咽癌的辅助诊断和预后判断生物标志物、有效的靶向治疗分子以及化疗药物增敏剂是亟需解决的问题。MMP1是基质金属蛋白酶家族中的成员,其异常高表达可见于多种恶性肿瘤之中,且表达水平与这些恶性肿瘤的临床病理特征密切相关。一些体内外实验证明MMP1对恶性肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移能力有促进作用,MMP1还被证明与化疗药物耐药有一定相关性。但是MMP1对下咽癌发生、发展的影响却鲜少研究,且MMP1对下咽癌顺铂耐药性的影响和机制目前无文献报道。研究显示AKT通路在多种恶性肿瘤中被激活,AKT通路的激活可以促进肿瘤细胞的增殖和转移、抑制肿瘤细胞的凋亡,并诱导顺铂和紫杉醇等化疗药物耐药性产生。本文以下咽癌为研究对象,从细胞、动物及临床样本水平研究了MMP1对下咽癌增殖、转移、顺铂耐药性产生以及AKT通路激活的影响,并对其机制进行了初步研究,试图为下咽癌的诊治提供新思路。方法:（1）通过q RT-PCR、WB实验检测了喉癌、舌癌、下咽癌、颊癌和扁桃体癌5种常见头颈鳞癌组织样本中MMP1的m RNA和蛋白表达水平,通过ELISA实验检测了13例头颈鳞癌患者血清中MMP1的蛋白表达水平;（2）使用LV-si MMP1敲低下咽癌细胞（Fa Du）中MMP1（LV-si MMP1的对照病毒为LV-CON313）,通过生长曲线、划痕实验和Transwell实验检测敲低MMP1的Fa Du细胞（Fa Du-si MMP1）及其对照细胞（Fa Du-CON313）的生长和迁移能力,并在失巢环境下检测MMP1表达对细胞死亡比例的影响;（3）通过WB实验检测AKT和p-AKT（Ser473）在Fa Du-si MMP1及Fa Du-CON313中的表达情况,并通过抑制AKT检测Fa Du细胞生长和迁移功能的变化;（4）通过Fa Du-si MMP1和Fa Du-CON313稳定转染细胞株进行裸鼠皮下成瘤实验,检测MMP1在体内对肿瘤细胞生长和转移的影响;（5）通过顺铂大剂量冲击和小剂量维持相结合的方法诱导下咽癌细胞（Fa Du）和食管癌细胞（Eca109）对顺铂产生耐药,耐药细胞分别命名为下咽癌顺铂耐药细胞（Fa Du/DDP）和食管癌耐药细胞（Eca109/DDP）,通过集落形成实验检测耐药细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC50）以验证其对顺铂的耐药性,并对Fa Du/DDP和Fa Du细胞进行基因芯片检测及差异表达基因生物信息学分析;（6）对基因芯片中的差异表达基因进行聚类分析、富集分析以及蛋白质互作（PPI）网络分析,初步探索顺铂耐药性产生的分子机制;（7）通过WB实验检测下咽癌和食管癌耐药细胞中MMP1的表达情况,并通过LV-si MMP1转染对耐药细胞中MMP1进行敲低、LV-MMP1对亲本细胞中MMP1进行过表达（LV-MMP1的对照病毒为LV-CON238）,通过WB实验检测MMP1敲低或过表达的情况以及AKT和p-AKT（Ser473）的变化情况;（8）对敲低MMP1的下咽癌耐药细胞（Fa Du/DDP-si MMP1）和食管癌耐药细胞（Eca109/DDP-si MMP1）及其对照细胞（Fa Du/DDP-CON313和Eca109/DDP-CON313）,过表达MMP1的下咽癌细胞（Fa Du-MMP1）和食管癌细胞（Eca109-MMP1）及其对照细胞（Fa Du-CON238和Eca109-CON238）进行集落形成实验和CCK-8实验检测其对顺铂的耐药性,分析并比较MMP1表达水平与IC50的相关性;（9）使用Fa Du/DDP-si MMP1、Fa Du/DDP-CON313、Fa Du-MMP1和Fa Du-CON238进行裸鼠皮下成瘤实验并对裸鼠腹腔注射顺铂,检测MMP1在体内对细胞顺铂敏感性的影响;（10）最后对敲低MMP1的耐药细胞和对照细胞进行基因芯片检测,并对基因芯片中的差异表达基因进行聚类分析、富集分析以及蛋白质互作网络分析,进一步探索MMP1诱导下咽癌顺铂耐药产生的可能分子机制。结果:（1）q RT-PCR结果显示头颈鳞癌组织中MMP1的m RNA水平上调倍数为49.770±25.431倍（p＜0.0001）,WB结果分别显示了头颈鳞癌组织中MMP1蛋白表达水平上调1.812至15.030倍（p＜0.05）,ELISA结果显示头颈鳞癌患者血清中MMP1蛋白表达水平上调2.11±1.29倍（p=0.03）;（2）Fa Du-si MMP1细胞中MMP1的m RNA水平下调0.072±0.026倍（p=0.0004）,而MMP1的蛋白水平下调0.0019±0.0006倍（p＜0.0001）;Fa Du-si MMP1细胞较Fa Du-CON313生长减慢,划痕实验示Fa Du-si MMP1迁移功能为Fa Du-CON313的44.98%±6.82%（p=0.015）,而Transwell实验显示Fa Du-si MMP1迁移能力仅为Fa Du-CON313的24.86%±1.58%（p＜0.0001）;Fa Du-si MMP1细胞在失巢环境下细胞死亡比例为Fa Du-CON313的1.180±0.006倍（p=0.007）;（3）Fa Du-si MMP1细胞AKT表达为Fa Du-CON313的0.594±0.0001倍（p＜0.0001）,而p-AKT（Ser473）减少的程度更高仅为0.282±0.00009倍（p＜0.0001）;抑制AKT后Fa Du细胞生长能力仅为对照的0.160±0.017（p=0.009）,划痕实验示抑制AKT后Fa Du细胞迁移功能下降至对照的74.15%±7.61%（p=0.020）,Transwell实验示其迁移能力下降至27.12%±9.70%（p=0.018）,抑制AKT后迁移能力下降程度略低于敲低MMP1;（4）裸鼠皮下成瘤实验显示敲低MMP1后下咽癌细胞原位瘤体大小无明显变化,但对肿瘤细胞肝转移有抑制作用;（5）诱导产生的下咽癌Fa Du/DDP细胞和食管癌Eca109/DDP细胞对顺铂的IC50分别为2581.33±350.78 n M（与Fa Du比较p=0.009）和2376.33±78.16 n M（与Eca109比较p＜0.0001）,耐药指数（RI）分别为3.69和3.62;（6）基因芯片在Fa Du/DDP中共检测出527个上调基因和218个下调基因,聚类富集和PPI网络分析显示趋化因子等免疫相关细胞因子以及其下游信号通路、细胞外基质与细胞膜受体的相互作用、DNA损伤的修复、细胞内外物质的转运和细胞内物质代谢是Fa Du/DDP细胞产生耐药性可能的主要分子机制;（7）耐药细胞中MMP1蛋白表达较亲本细胞高,Fa Du/DDP的MMP1蛋白表达为Fa Du的1.968±0.050倍（p＜0.0001）,而Eca109/DDP的MMP1蛋白表达为Eca109的2.801±0.025倍（p＜0.0001）;WB结果示敲低MMP1后MMP1蛋白表达水平下降,Fa Du/DDP-si MMP1的MMP1蛋白表达下降0.268±0.012倍（p＜0.0001）,Eca109/DDP-si MMP1的MMP1蛋白表达下降0.543±0.024倍（p＜0.0001）;而过表达MMP1后MMP1蛋白表达上升,Fa Du-MMP1的MMP1蛋白表达上调2.058±0.047倍（p＜0.0001）,Eca109-MMP1的MMP1蛋白表达上调2.112±0.140倍（p=0.0006）;（8）敲低MMP1后Fa Du/DDP和Eca109/DDP对顺铂敏感性增高:集落形成实验显示Fa Du/DDP-si MMP1对顺铂的IC50是对照组的0.47±0.16倍（p=0.024）,Eca109/DDP-si MMP1对顺铂的IC50是对照组的0.63±0.11倍（p=0.059）,CCK-8实验显示Fa Du/DDP-si MMP1对顺铂的IC50是对照组的0.57±0.04倍（p=0.0007）,Eca109/DDP-si MMP1对顺铂的IC50是对照组的0.57±0.03倍（p=0.0005）;（9）过表达MMP1后Fa Du和Eca109对顺铂耐药性增加:集落形成实验显示Fa Du-MMP1对顺铂的IC50为对照组的3.17±0.80倍（p=0.022）,Eca109-MMP1对顺铂的IC50为对照组的1.48±0.16倍（p=0.016）,CCK-8实验显示Fa Du-MMP1对顺铂的IC50为对照组的1.76±0.04倍（p＜0.0001）,Eca109-MMP1对顺铂的IC50为对照组的1.68±0.07倍（p=0.0014）;（10）敲低MMP1可以下调p-AKT（Ser473）蛋白表达,Fa Du/DDP-si MMP1中p-AKT（Ser473）的蛋白表达为其对照的0.620±0.021倍（p=0.0002）,Eca109/DDP-si MMP1中p-AKT（Ser473）的蛋白表达为其对照的0.555±0.034倍（p＜0.0001）;过表达MMP1可以上调p-AKT（Ser473）蛋白表达,Fa Du-MMP1中p-AKT（Ser473）的蛋白表达为其对照的1.324±0.026倍（p＜0.0001）,Eca109-MMP1中p-AKT（Ser473）的蛋白表达为其对照的1.211±0.037倍（p=0.002）;但敲低或过表达MMP1对总AKT表达的影响相对较小;（11）裸鼠皮下成瘤实验显示Fa Du-MMP1组较对照组在腹腔注射顺铂治疗后瘤体体积增长更多,Fa Du-MMP1组体积增长较Fa Du-CON238组多30.16±15.30 mm~3（p=0.016）;Fa Du-si MMP1较对照组在腹腔注射顺铂治疗后瘤体体积增长减少,Fa Du-si MMP1组体积增长较Fa Du/DDP-CON313组少42.40±3.19 mm~3（p=0.047）;（12）最后Fa Du/DDP敲低MMP1的基因芯片显示MMP1涉及糖代谢、蛋白泛素化和磷酸化、细胞间相互作用、上皮间充质转化、白介素等免疫分子及其下游通路、MAPK通路和NF-κB通路等参与下咽癌顺铂耐药。结论:MMP1在头颈鳞癌组织和血清中高表达,MMP1可以通过激活AKT通路促进下咽癌细胞体外增殖和迁移能力以及体内远处转移能力;MMP1还在顺铂耐药的下咽癌细胞中高表达,同时通过激活AKT通路降低下咽癌细胞对顺铂的敏感性。图50幅,表7个,参考文献126篇