研究背景：胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,研究显示近20年来该病(成人或儿童)的发生率逐渐增高。高级别的胶质瘤手术后6个月常常复发,尽管采用放疗和化学治疗等综合治疗,还是有80%的病人1年内死亡。多形性胶质母细胞瘤属高度恶性胶质瘤,尽管目前采用综合治疗及某些新的治疗策略但其中位生存期往往小于1年,且治疗后往往引起正常脑组织的继发性损害。恶性脑胶质瘤的发生发展过程是多因素影响的结果：(a)肿瘤抑制基因p53的功能缺失；(b)细胞分裂周期抑制基因功能缺失,如p16和p19；(c)生长因子受体的编码基因增殖和变异；(d)相关基因和蛋白的活化导致生长调控蛋白的生成,如蛋白激酶c。这些蛋白在肿瘤细胞的发生、增殖、转移以及对放疗和化疗的耐受都有着重要的作用。但是这些信号蛋白如何维持脑胶质肿瘤细胞的存活和增殖的作用机制并不十分清楚,可能与胶质瘤细胞的抗凋亡作用机制有关。近年研究发现,3-磷酸肌醇激酶(PI3K)/Akt途径、转录因子NF-κB、mTOR能增强脑胶质瘤细胞的抗凋亡作用。同时,研究发现活性氧族(ROS)作用于(PI3K)/Akt和转录因子NF-κB等靶点在维持细胞存活和增殖的信号转导通路中发挥重要的调节作用。活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)包括超氧离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)和氢氧根离子(HO-),传统地认为只是细胞代谢产生的毒素,外源性的H2O2可以促进许多类型的细胞凋亡或者坏死,因此,普遍认为ROS是影响细胞存活和增殖的有害因子；但是随着深入的研究发现ROS是细胞内重要的信号转导因子,并非只是核苷酸、蛋白质和其他细胞元件的有害因子,ROS可通过作用于PI3K/Akt、转录因子NF-KB等靶点,对细胞的增殖、凋亡及基因转录起着重要的调节作用。核因子κB(NF-κB)是一种多向调节功能的转录因子,广泛参与许多基因的转录调控,有研究表明其在肿瘤细胞增殖及凋亡中具有核心的调节作用。NF-κB由p50、p65这些分布最广泛的异源二聚体组成。细胞处于静息状态时,p50、p65通过与抑制蛋白IκB直接结合形成无活性的NF-κB／IK Bs复合物存留于细胞质,当胞外各种刺激信号传递到细胞质,一系列酶激活,致使IκB降解,活化的NF-κB二聚体进入细胞核,与核内DNA上特定靶基因的结合域结合,从而调控相应基因的表达。转录因子NF-κB的激活和NF-κB介导的基因转录均需要ROS的参与,减少细胞内ROS的生产,能有效阻断ROS依赖的p38和JNK信号通路从而抑制NF-κB的激活。参与细胞内ROS产生的酶体主要有NAD(P)H氧化酶(nicotinamide vadenine dinucleotide hphospate oxidase, NOX)、黄嘌呤氧化酶、脂氧化酶和环氧合酶、不偶联的一氧化氮合酶、线粒体呼吸链等,其中NAD(P)H氧化酶被认为可能是细胞内ROS产生的主要来源,但是NAD(P)H氧化酶及其衍生的ROS参与调控胶质瘤细胞的生长和凋亡的确切机制仍不是十分明确,细胞内ROS作为细胞内信号转导的第二信使可以调节多种下游因子的活性参与调控肿瘤细胞的生长和抗凋亡。因此本研究使用DPI抑制NAD(P)H氧化酶活性,减少细胞内ROS的产生,并使用细胞免疫荧光检测NAD(P)H氧化酶抑制剂对核因子κB(NF-κB)活化的影响,探讨了NAD(P)H氧化酶及细胞内ROS对胶质瘤细胞的增殖、存活、凋亡的影响。目的：1.研究NAD(P)H氧化酶及细胞内ROS对胶质瘤细胞存活、增殖和凋亡的影响。2.探讨NAD(P)H氧化酶对核因子κB(NF-κB)活化的影响方法：1.培养U251胶质瘤细胞,分组处理U251胶质瘤细胞：正常对照组：无处理因素组；DPI处理组：(1)5μM组,(2)15μM组,(3)25μM组；Tiron处理组：10mM Tiron。2.提取U251胶质瘤细胞总RNA, RT-PCR检测U251胶质瘤细胞系NOX基因的表达。3.细胞经DPI处理继续培养30分钟后,加入carboxy-H2DCFDA探针流式细胞术检测U251细胞内ROS的产生。4.细胞分组处理继续培养24小时后,使用alamarBlue法检测U251细胞的增殖。5.细胞分组处理继续培养24小时后,流式细胞术检测U251细胞的凋亡。6.细胞免疫荧光检测NAD(P)H氧化酶抑制剂DPI对核因子κB(NF-κB)活化的影响。结果：1.PCR结果显示U251胶质瘤细胞系中明显表达NOX4 mRNA。2.不同浓度DPI处理组均显著减少U251胶质瘤细胞内ROS的产生,与正常对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。3.相比正常对照组,各浓度DPI处理组(P<0.01)及lOmM Tiron (P<0.01)均能显著抑制U251胶质瘤细胞的生长,另外均能显著地诱导U251细胞凋亡(P<0.01)。4.NAD(P)H氧化酶抑制剂DPI能显著抑制核因子κB(NF-κB)的核转移。结论：1.NOX4可能是胶质瘤细胞内ROS生产的主要来源。2.NOX4可能通过增加细胞内ROS水平并作用于其下游调节分子,对胶质瘤细胞的生长、存活和凋亡起着重要的调节作用。3.NOX4增加细胞内ROS的水平,调控胶质瘤细胞内NF-κB的活化,调节细胞内的基因转录,从而影响胶质瘤细胞的增殖及凋亡。