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猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起,主要表现为妊娠母猪发生早产、流产、产死胎、弱仔和木乃伊胎,仔猪和育肥猪发生呼吸道疾病,死亡率增加,饲料报酬率降低。该病传播速度极快,是危害我国养猪业的一个重要传染病。疫苗免疫是控制该病发生的一个有效办法,但目前现有疫苗存在许多不足,如PRRSV 灭活疫苗免疫剂量大,接种次数多,不能激发黏膜免疫,保护效果不确实;弱毒疫苗虽然可以形成有效的临床保护,但和灭活疫苗一样不能阻止野毒感染,且存在着散毒和毒力返强之忧。所以利用生物技术手段开发能够激发黏膜免疫并能通过血清学方法区分野毒感染的安全和有效的新型PRRS 疫苗,来控制在我国日益泛滥的PRRS,是广大养猪企业的迫切需要。PRRSV 是单股正链RNA 病毒,属于尼多病毒目动脉炎病毒科,囊膜糖蛋白GP5 是PRRSV 产生中和抗体的主要靶抗原,PRRSV 自然感染动物血清中的中和抗体主要针对的就是GP5,据推测GP5 基因有一个由40 个氨基酸残基组成的区域,该区域有数个N 连接糖基化位点,PRRSV 的线形中和表位就预测在该区域。用含编码GP5 基因的质粒进行DNA 免疫,可使接种猪产生抗GP5 的特异性中和抗体,接种猪免于强毒攻击造成的全身性病毒血症和肺部病变,并使间质性肺炎和支气管肺炎明显减轻。由此可见GP5 基因是构建PRRS 基因疫苗和亚单位疫苗首选目的基因。本研究将CMV 启动子控制下的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH 1a 株GP5 基因和SV40 启动子控制下的LacZ 基因表达盒插入到伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)通用转移载体pBdTK-Uni 中,构建了含目的基因和报告基因的转移载体pGP5-LacZ,将pGP5-LacZ 与呈gE?表型的伪狂犬病弱毒疫苗Bartha-K61 株基因组DNA,通过脂质体法共转染Vero 细胞,经过10 代蓝斑筛选、蚀斑纯化和PCR 鉴定获得了一株稳定表达PRRSV GP5的重组伪狂犬病病毒,命名为rPRV-GP5。经生长动力学、表达动力学和间接免疫荧光试验证实,rPRV-GP5 感染细胞15 小时GP5 蛋白即可被Western blot 方法在感染的细胞中检测到,而在释放到上清中的病毒粒子上未检测到GP5,rPRV-GP5 感染细胞可以用PRRSV 特异抗体检测到胞浆荧光,证实表达的蛋白主要分泌到感染细胞的胞浆中或细胞膜上而不存在于病毒粒子表面,且表达蛋白的抗原性与亲本病毒相似。rPRV-GP5 在Vero、Marc-145、IBRS2 和CEF 细胞上毒价和细胞病变与亲本毒Bartha-K61 比较无显著差异。对第30 代rPRV-GP5 的GP5 基因进行序列分析和表达检测,表明rPRV-GP5 在传代过程中遗传性状稳定。10 只PRV 中和抗体为阴性,体重17~30kg 的5~6 月龄健康绵羊,随机分3 组:第I 组(3 只)为rPRV-GP5 安检组,每只肌注接种108.0 PFU;第II 组(4 只)为rPRV-GP5 效检组,每只肌注接种106.0 PFU;第III 组(3 只)为非接种对照组。接种后14 天,效检组和对照组每只绵羊肌注103LD50 PRV “双城系”猪源强毒S 株。结果表明rPRV-GP5 对PRV 敏感动物绵羊是安全的;对PRV 的强毒攻击具有100%的保护率,攻毒后第7 天和15 天采集鼻咽棉拭子,用gE 特异性引物未扩增到PRV gE 基因,说明rPRV-GP5 能阻止强毒的排毒。以上结果表明,rPRV-GP5 保留了其亲本毒Bartha-K61 株的安全性和免疫原性,其对伪狂犬病的免疫效力并