背景高脂肪饮食已经成为当前主要的饮食结构,与已成流行趋势的2型糖尿病发病相伴随。高温烹制的高脂肪餐富含晚期糖基化终末产物(Advanced glycation end products,AGEs,又称糖毒素,glucotoxing)。AGEs与其受体(RAGE)结合后可诱导发生氧化应激,导致胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)。IR是2型糖尿病主要发病机制之一。因此推测:长期进食富含AGEs的食物,使循环中AGEs超过了机体的清除能力;AGEs可以通过与其受体RAGE结合,使体内氧化应激水平升高,导致胰岛素抵抗,从而引起糖尿病发病。抑制AGEs形成、促进AGEs降解、阻断AGEs与RAGE的结合可减轻机体的氧化应激。因此,干预AGEs-RAGE系统可能有助于阻断糖尿病的发病过程。目的构建大鼠可溶性RAGE(soluble RAGE,sRAGE)基因表达载体,观察sRAGE表达对高脂餐诱导的大鼠体内氧化水平以及对大鼠糖尿病发病率的影响。方法1. sRAGE基因克隆及表达载体构建从大鼠肺组织中提取总RNA,根据其编码区基因设计引物,并在引物中加入SalI和ClaI酶切位点;行RT-PCR,将RT-PCR产物克隆到pMD18-T simple Vector中筛选阳性克隆并对插入片段(sRAGE)测序。用SalI和ClaI酶切pMD18-sRAGE,得到插入片段sRAGE,将该片段定向克隆至pLNCX2质粒的CMV启动子的下游(命名为pLNCX2-sRAGE) ,筛选阳性克隆并对插入片段(sRAGE)测序。2.质粒扩增与纯化应用大肠杆菌扩增pLNCX2-sRAGE以及pLNCX2,碱裂解法提取质粒。3.大鼠骨骼肌注射pLNCX2-sRAGE后sRAGE表达的检测取雄性SD大鼠6只(体重300g±10g,12周龄),随机分为2组。一组单侧骨骼肌转染pLNCX2-sRAGE质粒300μg,一组单侧骨骼肌转染pLNCX2质粒300μg,各组大鼠转染后均使用转基因仪给予方波电脉冲刺激增强其转染效率;一周后处死动物,取注射部位肌肉提取总RNA,并使用RT-PCR的方法检测sRAGE基因在大鼠肌肉组织mRNA水平的表达。4.大鼠骨骼肌注射pLNCX2-sRAGE对大鼠体内氧化水平的影响4.1预实验雄性SD大鼠12只(体重150～160g,6周龄),随机分为3组,每组4只:(1)高脂餐喂养+pLNCX2-sRAGE组:高脂饲料喂养8周后双侧股四头肌转染pLNCX2-sRAGE质粒,每侧300μg。(2)高脂餐喂养+pLNCX2组:高脂饲料喂养8周后双侧股四头肌转染pLNCX2质粒300μg。(3)普通饲料对照组:喂养普通饲料,未转染质粒。各组大鼠于转染质粒前以及转染后每一周取血,检测血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)。4.2正式实验雄性SD大鼠20只(体重150～160g,6周龄),随机分为2组(每组10只):(1)高脂餐喂养+pLNCX2-sRAGE组,(2)高脂餐喂养+pLNCX2组。质粒转染方法、剂量与预实验同。各组大鼠在转染第一次质粒3周时重复注射质粒一次,剂量同上;分别于2次转染前以及转染后7天、14天、21天、断尾取血测定SOD、MDA,评价其体内的氧化水平。5.肌肉注射pLNCX2-sRAGE转染对大鼠糖尿病发病率的影响方法4.2中高脂喂养的2组大鼠(每组n=10)在第二次转染质粒后的第三周后腹腔注射链脲佐菌素(STZ)30mg/kg;另取普通饲料喂养的20周龄雄性SD大鼠10只(350-380g),随机分为2组:一组(n=5)注射同等剂量STZ(30mg/kg);另一组(n=5)注射生理盐水。一周后测空腹血糖,以空腹血糖≥7.0mmol/L为达到糖尿病诊断标准。6.高脂喂养的大鼠不同处理组血胰岛素水平及胰岛胰岛素含量情况高脂喂养的大鼠注射STZ前采血,ELISA法测定血清胰岛素水平以及血糖水平。注射STZ一周后处死大鼠,取胰腺固定,石蜡切片,行胰岛素免疫组化染色,观察胰岛细胞胰岛素分泌情况。结果1.酶切和测序证实构建的sRAGE基因表达载体序列正确。2.肌肉注射pLNCX2-sRAGE后,注射部位肌肉mRNA用RT-PCR可以检测到sRAGE的mRNA表达。3.高脂饮食+pLNCX2-sRAGE组与高脂喂养+pLNCX2组体重无统计学差异(382g vs 380g,t=0.120,p=0.906)。4.转染pLNCX2-sRAGE后大鼠体内MDA水平开始下降,其作用可持续3周,第2周起的水平与对照组相比有统计学差异(5.36 vs 6.79,t=﹣7.458,p=0.000);SOD水平逐渐上升,第3周开始与对照组相比有统计学差异(152 vs 140,t=2.801,p=0.025)。重复注射后,MDA水平仍然可以下降,趋势同前;SOD水平则继续升高,但在第二次转染后2周后达到一定水平后则不再升高。5.肌肉注射pLNCX2-sRAGE组大鼠注射小剂量STZ后10只中仅有2只大鼠空腹血糖>7.0mmol/L ,对照组10中则有8只空腹血糖>7.0mmol/L。普通饲料喂养的2组大鼠无糖尿病发生。三组空腹血糖均值有统计学差异。6.高脂喂养并肌肉注射pLNCX2-sRAGE、注射pLNCX2及普通饲料喂养的大鼠在注射STZ前血糖无统计学差异(分别为4.81±0.472mmol/L、4.92±0.45mmol/L和4.96mmol/L±0.435mmol/L); pLNCX2-sRAGE组大鼠的血清胰岛素水平明显低于PLNCX2组大鼠,但高于普通饮食的同龄大鼠。7.大鼠胰岛免疫组化染色显示高脂喂养的2组大鼠胰岛分泌胰岛素含量均低于普通饮食组大鼠。与pLNCX2组大鼠比较pLNCX2-sRAGE组大鼠胰岛结构更加完整,胰岛素含量更接近普通饮食大鼠。结论1.成功地构建了大鼠sRAGE基因表达载体pLNCX2-sRAGE,该质粒在大鼠骨骼肌成功内表达。2.大鼠骨骼肌注射pLNCX2-sRAGE后可显著提高大鼠抗氧化能力、减轻氧化应激水平、减少STZ诱导的高脂餐大鼠糖尿病的发病率。