可植入性医用材料,包括组织工程与药物释放支架,目前的研究重点都放在力学强度、功能组分、拓扑结构、生物可降解性与表面化学性质等特性方面。但是,在临床应用中,决定移植成败的是组织重建过程中的免疫排斥反应。特别是纳米纤维这种具有超高比表面积的组织工程支架,往往会因为非特异性吸附大量的蛋白而引起慢性炎症,形成胶原纤维囊而导致功能丧失。目前的研究表明早期炎症中巨噬细胞的分化对调节宿主免疫排斥反应、调控移植物与宿主的整合至关重要。不同于其他免疫细胞(例如T淋巴细胞)的高度分化状态,巨噬细胞的M1/M2表型具有功能可塑性,可以根据微环境信号的类型、浓度、及持续时间的改变而进行动态调整。本研究的主要内容为通过层层自组装的方式在纳米纤维表面修饰丝素蛋白(Silk Fibroin,SF),降低材料的非特异性吸附,并通过点击化学反应将肝素寡糖(Heparin Disaccharide,HD)固定于纳米纤维表面用于特异性吸附细胞因子白介素4(Interleukin-4,IL-4)来主动调控巨噬细胞的功能分化以降低植入体的免疫排斥反应,主要研究内容与结果如下:(1)通过静电纺丝制备聚己内酯(poly-ε-caprolactone,PCL)纳米纤维,并通过层层自组装和点击化学的方式修饰纳米纤维。扫描电镜、共聚焦荧光显微镜、力学测试、厚度测试的结果显示SF的自组装修饰不改变纳米纤维的整体结构,但随着组装层数的增加,纳米纤维的厚度增加;同时组装过程中的90%甲醇处理增加了SF的β折叠,最终增加了纳米纤维的力学强度。红外与紫外光谱的结果显示通过点击化学的方式在纳米纤维表面固化HD具有可行性,固化后的纳米纤维表面可以观察到糖类的红外特征峰。接触角测试结果表明并且HD还能改善纳米纤维的亲水性。蛋白吸附分析结果表明SF的修饰降低了纳米纤维的非特异蛋白吸附,而HD固化后可以特异性的结合细胞因子IL-4,为其调控免疫排斥反应打下良好的基础。(2)在体外(in vitro)和体内(in vivo)验证了IL-4作为免疫调节因子对纳米纤维支架M1/M2型巨噬细胞的功能调节能力。免疫荧光和免疫组化结果证明,在炎症反应的开始阶段,IL-4具有“功能性”激活巨噬细胞的能力,之后迅速地将M1型巨噬细胞转化为M2型巨噬细胞。HE染色和MASSON胶原染色结果证明巨噬细胞的早期功能调节可以抑制免疫排斥反应,减少胶原纤维囊的产生。本研究首次将HD应用于纳米纤维的表面功能化。实验结果发现HD除了作为“桥梁”调节所绑定的细胞因子活性外,自身对巨噬细胞也有直接的调节作用,会降低巨噬细胞的极化从而减少免疫细胞的招募。(3)通过RNA转录组测序探讨巨噬细胞在纳米纤维上的分化机理。转录组整体质量评估,PCR验证结果表明本次测序分析准确可靠,具有参考性。差异基因GO富集分析结果表明纳米纤维影响巨噬细胞代谢、凋亡、周期、信号传递、免疫功能等行为。KEGG信号通路富集与可视化的分析结果表明TNF信号通道、PI3K-Akt信号通道、MAPK的JNK和ERK信号通道以及NF-κB的反馈机制在纳米纤维调控巨噬细胞分化不同表型中起到重要作用,为后续研究巨噬细胞在纳米纤维上表型异质性和功能可塑性的精确分子机制指明方向。综上所述,本研究利用生物材料的表面修饰与细胞因子对早期炎症阶段的巨噬细胞分化进行调节成功降低纳米纤维的免疫排斥反应,为设计新一代“免疫调节型”组织工程支架提供了理论与实践参考价值。