背景目前,肥胖人数在世界范围内大量增加,引起了人们的广泛关注。肥胖患者被认为体内处于慢性低度炎症状态。IκB-α/NF-κB炎症信号通路,可以被游离脂肪酸等物质激活,介导下游炎症因子的过量表达,其在肥胖小鼠的胰岛素抵抗中发挥着重要作用。NLRP3炎症小体可引起下游炎症因子的表达增加,引发NF-κB被磷酸化激活,其转移进入细胞核内,进一步刺激炎症因子的过度释放。肥胖个体内胰岛素作用的靶组织中炎症因子的表达明显增高,其介导的炎症反应在胰岛素抵抗中起到关键作用。肥胖个体内,胰岛素受体可使底物发生磷酸化,并进一步抑制PI3K和AKT的激活,从而引起肝脏、脂肪组织、骨骼肌的胰岛素抵抗状态明显加重。肥胖个体内,肝脏组织中脂肪大量累积,这一过程受到JAK/STAT信号通路介导的细胞因子调控。SREBP-1c和FAS都是肥胖个体内,促进肝脏脂质合成的关键分子。生胃酮是甘草酸的衍生物之一,目前的研究局限于对肥胖个体内脂肪组织炎症状态的探讨,对肝脏及骨骼肌炎症状态的相关研究极少;因此本实验着重研究生胃酮提高肥胖小鼠肝脏及骨骼肌胰岛素敏感性的分子机制及其改善肝脏脂质代谢的相关机制。第一部分,生胃酮改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠肝脏脂质代谢的机制研究[目的]1.研究高脂饮食诱导的肥胖小鼠体内,肝脏发生脂质代谢紊乱并诱发血脂增高的机制。2.研究生胃酮对肥胖小鼠肝脏JAK2/STAT3信号通路的影响,探讨生胃酮改善肝脏脂质代谢紊乱的机制,为治疗肥胖伴高脂血症提供新的思路。[方法]1.给予小鼠每日进食高脂饮食共8周,诱导肥胖小鼠模型建立。之后生胃酮组小鼠每日予生胃酮（Carbenoxolone,CBX）灌胃给药共12周。实验期间每周监测各组小鼠的体重及进食量,并进行比较。2.实验结束后处死所有小鼠,ELISA法测定小鼠血清中甘油三酯（Triglycerides,TG）、胆固醇（Total cholesterol,TC）、低密度脂蛋白（Low density lipoprotein,LDL）、高密度脂蛋白（High density lipoprotein,HDL）、谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase,ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）的变化。3.处死小鼠后,各组取少量肝脏组织,石蜡包埋行HE染色,光镜下观察肝脏的病理形态学改变。另取少量肝脏组织,制作冰冻切片,行油红O染色,光镜下观察肝脏病理形态学改变。4.小鼠肝脏组织,石蜡包埋切片后,采用免疫组化法检测转录因子固醇结合蛋白-1c（Sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase,FAS）、细胞因子信号转导负调控蛋白-3（Suppressor of cytokine signaling-3,SOCS-3）蛋白的表达变化。5.取少量肝脏组织,采用荧光定量PCR法检测各组肝脏中SREBP-1c、FAS、SOCS-3 mRNA的表达变化。6.取小鼠的肝脏组织,采用Western blot法检测白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-a（Tumor necrosis factor-a,TNF-a）、酪氨酸激酶2/信号转导转录激活因子3（Janus kinase 2/Signal transducer and activator of transcription 3,JAK2/STAT3）信号通路相关蛋白的表达变化。[结果]1.各组体重及进食量的变化:与正常组小鼠相比,肥胖组小鼠进食高脂饮食八周后,体重显著增加（p＜0.01）;生胃酮组小鼠给予CBX灌胃12周后体重有所减轻,差异亦有统计学差异（p＜0.05）。此外随着饲养时间的延长,各组小鼠进食量均未见明显差异（均p＞0.05）。2.肝功能及血脂的变化:与正常组相比,肥胖组小鼠的TG、TC、LDL均显著增加,HDL显著降低,差异有统计学意义（p＜0.01）。而小鼠经CBX灌胃12周后其TG、TC、LDL的浓度显著降低,HDL显著增加,差异亦有统计学意义（p＜0.05）。对于肝功能ALT及AST进行比较,三组均未见统计学差异（均p＞0.05）。3.肝组织HE染色结果（光镜下放大400倍）:正常组小鼠肝脏的形态及结构均正常;肥胖组小鼠的肝细胞发生气球样变,肝细胞内脂质大量积聚,且肝组织内炎症状态亦有所加重;然而CBX灌胃后可显著减轻肥胖小鼠肝细胞内脂质堆积,改善肝细胞气球样变。肝组织行油红O染色结果:与对照组比较,肥胖组肝脏中脂滴大量积聚,脂质沉积显著增加;而CBX组经灌胃后可以显著减少肝脏内的脂质沉积。4.肝脏脂质代谢的变化:与正常组相比,肥胖组小鼠肝脏中SOCS-3、SREBP-1c及FAS蛋白的表达均显著增加,差异均有统计学意义（均p＜0.01）。然而给予CBX灌胃给药12周后,小鼠肝脏中SOCS-3、SREBP-1c及FAS蛋白的表达均显著减少,差异亦有统计学差异（均p＜0.05）。5.与正常组相比,肥胖组小鼠肝脏中SREBP-1c、FAS和SOCS-3的mRNA的表达显著增加（p＜0.01或p＜0.05）。然而给予CBX灌胃后,肝脏中SREBP-1c、FAS和SOCS-3的mRNA的表达均显著下降,差异亦存在统计学意义（p＜0.05）。6.肝脏JAK2/STAT3通路的变化:与正常组相比,肥胖组肝脏中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3的比值均显著降低,差异均有统计学意义（p＜0.01）;然而给予CBX灌胃12周后,肝脏中p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3的比值均显著增加,差异亦有统计学意义（p＜0.05）。7.与正常组相比,肥胖组小鼠肝脏中TNF-a、IL-6蛋白的表达均显著增加（均p＜0.01）。然而给予CBX灌胃12周后,小鼠肝脏中TNF-a、IL-6蛋白的表达有所降低,差异亦存在统计学意义（p＜0.05）。[结论]1.高脂饮食诱导的肥胖小鼠肝脏内,JAK2/STAT3信号通路的活性被抑制,进一步引起肝脏脂质合成相关蛋白SREBP-1c、FAS的表达增加,并加剧了肝脏的炎症状态,从而导致肥胖小鼠肝脏中脂质大量蓄积。2.生胃酮通过激活肥胖小鼠肝脏内JAK2/STAT3信号通路,进一步减少了肝脏脂质合成相关蛋白SREBP-1c及FAS的表达,从而减少了肝脏的脂质合成,此外其亦改善了肝脏的炎症状态,因此明显减轻了肥胖小鼠肝脏的脂质代谢损伤。第二部分,生胃酮改善高脂饮食诱导的肥胖小鼠的胰岛素抵抗及炎症状态的机制研究[目的]1.研究高脂饮食诱导的肥胖小鼠体内,肝脏及骨骼肌组织的炎症状态及诱发机体胰岛素抵抗加剧的分子机制。2.研究肥胖小鼠体内,生胃酮通过减轻肝脏及骨骼肌组织的炎症状态,提高胰岛素敏感性、改善胰岛素抵抗的分子机制。[方法]1.诱导肥胖小鼠模型成功建立后,生胃酮组小鼠每日予生胃酮灌胃干预共12周,实验结束前每组小鼠行糖耐量试验（Glucose tolerance test,GTT）。2.实验结束后处死小鼠,ELISA法测定各组小鼠血清中空腹血糖（Fasting plasma glucose,FPG）、胰岛素（Insulin）的表达变化。3.各组取少量骨骼肌及肝脏组织,采用荧光定量PCR法分别检测各组骨骼肌及肝脏组织中 IL-1β、NLRP3、Caspase-1 mRNA 的表达变化。4.取少量肝脏及骨骼肌组织,石蜡包埋切片并行HE染色,光镜下观察各组肝脏及骨骼肌的病理形态学改变。5.取各组小鼠的骨骼肌及肝脏组织,石蜡包埋并切片后,采用免疫组化法分别检测各组小鼠骨骼肌及肝脏组织中IL-1β、Caspase-1、p-IκB-α、p-NF-κB蛋白的表达变化。6.取各组的骨骼肌及肝脏组织,采用Western blot法分别检测IκB-α/NF-Kb信号通路相关蛋白、NLRP3蛋白及IRS-1/PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达变化。[结果]1.各组糖耐量的变化:与正常组相比,高脂饮食诱导的肥胖组小鼠表现出受损的糖耐量水平,差异有统计学意义（p＜0.01）;然而肥胖小鼠经CBX灌胃给药十二周后,其糖耐量水平得以明显改善,差异亦存在统计学意义（p＜0.05）。2.各组血糖及胰岛素的变化:与正常组相比,高脂饮食诱导的肥胖组小鼠的空腹血糖、胰岛素均显著增加（p＜0.01）。然而生胃酮干预组小鼠的空腹血糖、胰岛素水平均明显下降,差异亦有统计学意义（p＜0.05）。3.各组NLRP3炎症体及炎症因子基因的变化:与正常组相比,高脂饮食喂养的肥胖组小鼠的骨骼肌及肝脏组织中NLRP3、IL-1β、Caspase-1 mRNA的表达均显著增加（均p＜0.05）。而CBX组小鼠经灌胃12周后,其骨骼肌及肝脏组织中NLRP3、IL-1β、Caspase-1 mRNA的表达均明显减少,差异亦存在统计学差异（均p＜0.05）。4.骨骼肌HE染色结果（光镜下放大400倍）:正常组小鼠骨骼肌的形态及结构均正常;与正常组相比,肥胖组小鼠的骨骼肌内脂肪堆积明显增加;而CBX灌胃组小鼠的骨骼肌内脂肪积聚有所减轻。5.NLRP3炎症体及炎症因子蛋白的变化:与正常组相比,肥胖组小鼠骨骼肌及肝脏组织中IL-1β、Caspase-1、NLRP3、p-IκB-α、p-NF-κB 蛋白的表达均显著增加（均p＜0.05）。然而 CBX灌胃组小鼠的骨骼肌及肝脏组织中IL-1β、Caspase-1、NLRP3、p-IκB-α、p-NF-κB蛋白的表达有所减少,差异亦有统计学意义（均p＜0.05）。6.IκB-α/NF-Kb通路、IRS-1/PI3K/AKT通路关键蛋白的变化:与正常组相比,肥胖组肝脏及骨骼肌中 p-IRS-1/IRS-1、p-IκB-α/IκB-α、p-NF-κB/NF-κB 比值均显著增加,而 p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值均显著降低,差异均有统计学意义（p＜0.05）。然而CBX组小鼠经灌胃干预后,该组肝脏及骨骼肌中p-IRS-1/IRS-1、p-IκB-α/IκB-α、p-NF-κB/NF-κB 比值均有所减少,而p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的比值均有所增加,差异亦存在统计学意义（p＜0.05或p＜0.01）。[结论]1.高脂饮食诱导的肥胖小鼠肝脏及骨骼肌内,IκB-α/NF-κB信号通路被激活后,可以进一步上调NLRP3炎症小体及相关炎症因子的表达,增加p-IRS-1的表达,减少p-PI3K及p-AKT的表达,从而加重肥胖小鼠肝脏及骨骼肌的胰岛素抵抗状态。2.生胃酮通过抑制肥胖小鼠肝脏及骨骼肌内IκB-α/NF-κB信号通路,进一步减少NLRP3炎症小体及炎症因子的表达,此外下调p-IRS-1的表达,上调p-PI3K及p-AKT的表达,起到改善肥胖小鼠肝脏和骨骼肌的炎症状态、减轻胰岛素抵抗的作用。