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转基因粮食作物的食用安全性问题一直是公众争议的热点,也是转基因粮食作物迄今为止在全国乃至全球范围内尚未能得以商业化或广泛商业化种植的重要原因。2012-2016年期间,本课题组利用水稻绿色组织特异性表达启动子rbcS、位点特异性重组系统Cre/loxP、核定位信号krp2和终止子nosT等组件,致力开发了一种“基因开关”系统,使其控制的外源基因只在除种子外的绿色组织部位精确表达,为转基因作物食用安全性问题提供了全新和可行的解决途径。为了成功将“基因开关”系统由基础研究推向农业生产应用,本文以“基因开关”系统为核心,围绕胚乳零表达型两系抗虫及抗除草剂杂交水稻亲本种质创造及其组合选育工作展开研究,所获得的主要研究结果如下:一、“基因开关”系统在两系杂交水稻上的工作状况被证实是可行的:选用实验室已有的基因开关转化的两系亲本材料配制了 5个不同的抗虫杂交组合201S-K1/ZR6-LB2、201S-K4/ZR6-LB2、201S-K17/ZR6-LB2、201S-K17/551-LB6和604S-K5/ZR6-LB2,并分别于.水稻分蘖、抽穗和灌浆三个时期检测其叶片、茎秆以及灌浆完熟期糙米和精米中Cry1Ab/1Ac蛋白的含量。结果显示,抗虫蛋白Cry1Ab/1Ac在所配5个杂交组合的叶片及茎秆中都能有效表达,其中,叶片中测得的含量落在270ng/g-1020ng/g之间,而茎秆中测得的含量分布于160ng/g-410ng/g之间,且所有杂交组合的糙米及精米中的Cry1Ab/1Ac蛋白含量均与野生型对照无显著差异。室内人工接虫及田间自然爆发抗性鉴定结果显示:各基因开关杂交组合的抗虫性良好,其室内叶片样本二化螟致死率为100%,极显著高于阴性对照的12.04%;田间卷叶螟危害率仅0.72%,极显著低于对照的62.81%;农艺性状考察结果显示:各性状指标与野生型对照相比均无不利改变。这些结果因此表明,“基因开关”系统在这些两系杂交组合中如所预期一样工作正常,同时该结果也证明应用基因开关系统培育胚乳零表达抗虫蛋白的抗虫两系杂交水稻完全可行。二、成功地应用“基因开关”系统创制了无标记的抗虫两系杂交水稻:分别以本实验室自育的优质不育系201S和恢复系551为受体,进行新一轮的遗传转化和种质创新,获得了一批新的201S-KEY(含Cre基因)和551-LB(含Cry1Ab/1Ac基因)独立转化体,并通过PCR阳性检测和Southern杂交拷贝数鉴定筛选出无标记的转化系201S-KEY9和KEY12和551-LB1、LB7、LB13和LB16,其中,551-LB7、LB16为单拷贝纯系,将它们相互配组共获得5个杂交组合:201S-K9/551-LB1、201S-K9/551-LB7、201S-K9/551-LB13、201S-K9/551-LB16、201S-K12/551-LB1。杂种F1代苗期叶片的ELISA分析结果显示:Cry1Ab/1Ac蛋白在所有这5个无标记的单拷贝杂交组合中均有效表达,而且有效范围的蛋白含量正处在130ng/g-630ng/g之间。三、成功地应用“基因开关”系统创制了抗除草剂两系杂交水稻:以华中农业大学刘子铎教授提供的新型抗草铵膦除草剂基因RePAT为目的基因,以本课题组自育的优良恢复系112为受体进行农杆菌介导的遗传转化法,共获得数十份独立转化体,并通过PCR阳性检测和Southern杂交拷贝数分析,鉴定出一批无标记的单拷贝转化系。之后,选其部分转化系与前面获得部分的201S-KEY转化系配组,也配制出 5 个杂交组合:201S-K17/112-LR1、201S-K4/112-LR16、201S-K1/112-LR21、201S-K1/112-LR24、201S-K4/112-LR26。杂种F1 代qRT-PCR分析结果显示,在mRNA水平上,抗草铵膦基因RePAT在这5个杂交组合中均能正常表达;以在苗期及分蘖期叶片上涂抹草铵膦的方式进行的抗性鉴定结果显示,当草铵膦涂抹浓度在≤250mg/L时,转基因叶片完全不受影响,当草铵膦浓度达到350mg/L时,转基因叶片开始受轻微影响,达到500mg/L时才出现较严重的受害症状;而与之成鲜明对比的是,当草铵膦涂抹浓度在100mg/L时便开始对非转基因叶片产生影响,当达到150mg/L时便能使非转基因叶片呈现严重受害症状,以致变黄枯萎。这些结果说明基因开关控制的抗除草剂基因RePAT在两系杂交稻上也工作正常。