人骨髓间充质干细胞成骨及成软骨分化中长链非编码RNA的初步研究

被引量 : 0次 | 上传用户:lwk2293366
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
研究背景间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来源于中胚层的多潜能干细胞,其具有很强的自我更新和多项分化潜能。在给予适宜的体内或体外诱导环境下,其可分化为成骨细胞、软骨细胞及脂肪细胞等。间充质干细胞是骨与软骨组织工程研究常用的种子细胞,在再生医学研究中具有广阔的应用前景。骨髓来源的间充质干细胞因获取和培养简单方便,是目前使用最为广泛、研究最多的间充质干细胞。间充质干细胞的成骨、成软骨定向分化是干细胞研究的热点,目前其具体的定向分化机制仍不明了。长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白的RNA。其占到非编码RNA的80%以上,但却是目前研究及了解最少的一类RNA。其不具有蛋白编码功能,但研究发现lncRNA在生长发育与分化过程中发挥重要作用。lncRNA具有复杂的生物学功能,参与机体诸多生物学行为,并与人类疾病的发生、发展和防治有密切的关系。然而关于lncRNA在人骨髓间充质干细胞成骨、成软骨定向分化过程中的作用尚无系统的报道和研究。该研究对于间充质干细胞定向分化过程中的IncRNAs进行了初步筛选,为后续的机制研究奠定了基础。目的1.对人骨髓间充质干细胞进行成骨及成软骨诱导分化,为筛选与定向分化有关的lncRNA提供细胞样本。2.利用Agilent human lncRNA+mRNA Array V4.0微阵列芯片技术分别筛选人骨髓间充质干细胞成骨分化组与未分化组、成软骨分化组与未分化组之间差异表达的IncRNAs和mRNAs。3.利用生物信息学技术对差异表达的lncRNA和mRNA进行分析,筛选可能参与定向分化过程的lncRNA,预测其潜在的生物学功能。研究方法1.对人骨髓间充质干细胞进行细胞培养,对P3 MSCs分别进行成骨及成软骨诱导分化,分别设立实验组及对照组。在诱导分化后Day 14进行细胞染色及相关基因的检测进行诱导分化的验证。2.分别取3个成骨诱导分化、3个成软骨诱导分化和3个正常培养未分化Day 14的细胞样本作为芯片检测样品,提取细胞样本的总RNA。经质控合格后,利用Agilent human lncRNA+mRNA Array V4.0微阵列芯片技术对定向分化组与对照组之间差异表达的lncRNAs和mRNAs进行筛选。3.通过Gene Ontology、Pathway分析以及构建lncRNA和mRNA的共表达CNC网络图等生物信息学分析,进一步分析差异表达的lncRNAs,筛选可能与定向分化有关的lncRNAs,初步探讨其生物学功能。4.采用qRT-PCR对芯片检测结果进行验证,并检测感兴趣的相关的lncRNAs在定向分化过程中的动态表达情况。研究结果1.我们对MSCs原代细胞进行培养,在传代培养至P3时分别进行成骨及成软骨诱导分化。我们采用ALP、茜素红染色及成骨相关基因ALP、Runx2及Col Ⅰ的检测进行成骨分化的鉴定。对于成软骨分化,阿利新蓝染色、免疫组化染色(Aggrecan、Sox-9、 Col Ⅱ)以及成软骨相关基因Aggrecan、Sox-9、Col Ⅱ的检测均表明了其成功诱导。2.通过对芯片检测结果进行初步分析整理,成骨分化组与未分化组间共有1206条lncRNAs差异表达(FC>2.0或<-2.0, P-value<0.05),其中差异高表达的lncRNAs有687条,差异低表达的519条。另外,差异表达的mRNAs共2143条,其中上调表达的mRNA有957条,下调表达的mRNA有1186条。qRT-PCR对其表达情况进行验证,结果与芯片结果一致。3.成软骨分化组与未分化组间共有3638条lncRNAs差异表达(FC>2.0或<-2.0, P-value<0.05),其中差异高表达2166条,差异低表达1472条。差异表达的mRNAs共5560条,其中上调1980条,下调3580条。qRT-PCR的验证结果与芯片结果一致。4.通过GO、Pathway分析及CNC网络图构建,对相关的lncRNAs进行了分析及生物学功能的预测。分别对lncRNA-H19和uc022axw.1在成骨分化过程中以及lncRNA-ZBED3-AS1和CTA-941F9.9在成软骨分化过程中的动态表达情况进行了观察,提示其可能参与MSCs的定向分化过程。结论1.本实验研究以人骨髓间充质干细胞为研究对象,对其进行了成骨及成软骨诱导分化,并进行了细胞染色和分化相关基因的检测进行了验证,为芯片检测提供了可靠的细胞样本。2.首次系统报告通过微阵列芯片筛选了人骨髓间充质干细胞成骨、成软骨分化与未分化之间间差异表达的lncRNAs和mRNAs,并通过GO、Pathway分析以及CNC网络图构建等生物信息学技术对差异表达的lncRNAs和mRNAs进行分析,初步探讨了lncRNA的生物学作用。3. lncRNAs在MSCs成骨及成软骨分化过程中存在差异表达,提示其可能在定向分化过程中的潜在作用。关于lncRNAs具体参与的调控机制需要后续的功能研究进一步探讨。
其他文献
<正>中国五金行业都是典型的"出口型"行业,出口一直是中国五金行业的"发动机"。但2008年末爆发的国际金融危机严重打击了中国五金行业的"出口发动机",导致五金行业陷入困局,
目的中医药联合针灸治疗呃逆的临床观察推广运用。方法将患者随机分为治疗组和对照组。治疗组口服中草药,同时应用针灸治疗;对照组单纯应用中草药治疗,辨证用药同治疗组。两
我国是农业大国,农业、农村、农民是我们国家一直高度关注的"三农"问题。长期以来我国走的都是高消耗、高污染的发展道路,在农业方面主要是实现粗放式的农业生产经营模式。在
内蒙古节事旅游蓬勃发展,数量众多而质量较差。因此,对内蒙古节事旅游进行系统详细地研究,探讨其存在的内在不足、寻求其可持续发展的运作机理至关重要。昭君文化节作为呼和
<正>河北省属典型的资源性缺水省份,水资源严重匮乏,已造成一系列生态及社会问题。目前,用足用好黄河水,是解决该区域水资源严重短缺的有效途径。为此,我院受水利厅委托编制
蠕变时效成形技术主要用于大型飞机整体壁板的成形,是利用金属的蠕变特性,将成形与时效同步进行的一种成形方法。蠕变时效成形是蠕变和时效相互影响的过程,预变形、预时效、
目的评价生理盐水在成人外周静脉留置针封管中的效果。方法计算机检索Cochrane图书馆、JBI循证护理中心图书馆、Medline和中国生物医学文献数据库(CBMdisc),收集关于外周静脉
国内大部分对环境传播进行的研究研究多以中国城市化水平较高的地区的环境议题作为研究对象,对少数民族地区的关注却不多,且研究大都缺少实地调研经验和一手资料。本文把云南
数控机床日益向高速度、高精度和高效率的方向发展,要求我们采用先进的动态设计方法来提升我国机床企业的竞争力。该方法的前提是建立准确的含有结合面的机床动力学模型。直
目的:探讨实施腰椎间盘突出症临床路径对腰椎间盘突出症患者在疗效,平均住院日,住院费用,病人满意度等方面的影响。方法:采用前瞻性随机对照研究,研究组为广东省中医院珠海医院