辣椒疫病抗性相关基因CaAP2/ERF的功能鉴定及调控机理研究

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:hhzzmm
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辣椒是一种重要的蔬菜作物,而疫病严重危害辣椒的产收,因此挖掘疫病抗性基因对于辣椒的抗疫病育种有重要意义。ERF基因在植物应对病原菌侵染的抗性反应中有重要作用,因此本研究首先对辣椒AP2/ERF基因家族成员进行鉴定,研究了辣椒CaAP2/ERF基因的组织表达特性及其在不同生物胁迫下的表达特征,并对其启动子中的顺式作用元件进行预测与分析,接着利用VIGS技术将CaAP2/ERF基因沉默后进行抗病性鉴定与筛选,最后利用烟草瞬时表达、酵母单杂交与烟草的遗传转化等技术对辣椒CaAP2/ERF064、CaAP2/ERF109与CaAP2/ERF049基因在植物抗疫病反应中的功能及其与辣椒PR基因CaBPR1之间的调控关系进行研究解析,主要结果如下:1.辣椒基因组中包含175个AP2/ERF基因。亚细胞定位结果表明CaAP2/ERF127蛋白定位于细胞核,而CaAP2/ERF129与CaAP2/ERF171蛋白质则分布在细胞质与细胞核中。组织表达特性分析表明CaAP2/ERF基因在根与果实中有较高的表达水平。不同CaAP2/ERF基因在病菌的侵染与植物激素的处理过程中均具有特异的表达特征。启动子元件分析表明多数辣椒CaAP2/ERF基因含有响应植物激素、逆境胁迫与生物胁迫的作用元件。此外,外源乙烯(ethephon,ETH)处理可增强辣椒防御基因CaBPR1、CaPR10、CaSAR82与CaPO2的转录表达。利用VIGS技术将差异表达基因CaAP2/ERF064、CaAP2/ERF078、CaAP2/ERF086、CaAP2/ERF113、CaAP2/ERF127与CaAP2/ERF129分别沉默后进行抗病性鉴定与筛选,结果表明CaAP2/ERF064基因的沉默可显著影响辣椒对疫病的抗性反应。2.表达分析表明CaAP2/ERF064基因的转录受茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)与ETH激素信号协同调控。CaAP2/ERF064蛋白定位于细胞核与细胞质。酵母转录激活试验结果表明CaAP2/ERF064基因属于转录激活因子,通过对其不同缺失突变体的转录活性进行检测后发现其转录激活结构域可能位于蛋白C端。CaAP2/ERF064基因与P19在烟草中的瞬时共表达会诱发坏死反应,而其缺失突变体N2在烟草中的过量表达可引发叶片下表皮细胞的坍缩,CaAP2/ERF064蛋白的N端、AP2结构域与C端对于坏死反应的引发都是不可或缺的。酵母单杂交试验表明辣椒CaAP2/ERF064与CaAP2/ERF109基因均可与CaBPR1基因的启动子互作结合。此外,辣椒CaBPR1基因在不同激素组合处理后的表达变化特征与CaAP2/ERF064基因相似,而其在烟草中的瞬时过量表达虽不能诱发坏死反应,但可增强植株对疫霉菌的抗性。CaAP2/ERF064基因在辣椒中的沉默与其同源基因NbERF1B-l在烟草中的沉默均可减弱植株的抗病反应,而CaAP2/ERF064基因在烟草中的超表达可提高植株防御基因(NbPR1b、NbGLA与NbCHN)的转录水平,并显著增强植株对疫霉菌的抗性反应。最后通过不同转基因烟草株系的杂交构建了pCaMV35S:CaAP2/ERF064/Pro CaBPR1:CaBPR1双转基因烟草株系,且双转基因植株中CaBPR1基因的表达量检测结果表明CaAP2/ERF064基因可激活CaBPR1基因的转录。3.表达分析表明与ETH激素处理相比,水杨酸(salicylic acid,SA)、ETH与MeJA激素的组合处理可显著增强CaAP2/ERF109基因的转录。CaAP2/ERF109蛋白定位于细胞核(核仁),且其在烟草中的瞬时过表达可增强植株对疫霉菌的抗性。CaAP2/ERF109基因在辣椒中的沉默不能显著影响植株对疫霉菌的抗性反应,而CaAP2/ERF109基因在烟草中的过表达会造成植株分蘖增多、株高降低与叶形近椭圆,可提高渗透调节蛋白基因NbOSM的表达水平并提升烟草植株对干旱胁迫的耐受性,也可提高烟草NbPR1b、NbNPR1、NbPR1a、NbGLA与NbCHN50基因的表达并增强植株对辣椒疫霉菌的抗性。双转基因烟草株系pCaMV35S:CaAP2/ERF109/ProCaBPR1:CaBPR1中CaBPR1基因的检测结果表明CaBPR1基因的表达受CaAP2/ERF109基因调控,且辣椒CaAP2/ERF109基因对CaBPR1基因的转录激活活性强于CaAP2/ERF064基因。4.表达分析表明与ETH激素处理相比,SA与ETH激素的组合处理可显著提高辣椒CaAP2/ERF049(CaPTI1)基因的表达水平。CaAP2/ERF049基因在烟草中的过量表达可增强烟草植株对疫霉菌的抗性,而pCaMV35S:CaAP2/ERF049/Pro CaBPR1:CaBPR1双转基因烟草植株中CaBPR1基因的表达量检测结果表明CaAP2/ERF049基因不能激活CaBPR1基因的转录。此外,CaAP2/ERF049基因启动子的5’片段缺失试验结果表明其启动子序列中的-720-1151 bp区域在植株受疫霉菌侵染过程中CaAP2/ERF049基因的转录增强有重要作用。
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