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磷是生物体生命活动所需营养元素之一,在生物代谢中起着十分关键的作用。溶磷微生物能够将土壤中难溶性磷转化成容易被植物吸收利用的可溶性磷的形式,提高土壤中有效磷的含量,促进植物生长。目前对于溶磷微生物分子生物学机理主要集中在直接氧化途径上,其他方面研究较模糊。本实验通过对实验室筛选出的具有较强溶磷能力的溶磷菌株wj1在以难溶性磷酸盐和可溶性磷酸盐为唯一磷源的培养条件下进行转录组测序分析,挖掘功能相关基因,揭示不溶性磷酸盐存在时菌体的适应性调节过程及溶磷机制,同时从菌体多个代谢途径的角度综合解析菌株在磷代谢过程中关键酶基因的差异,对显著性差异表达的基因进行克隆及功能分析,具体研究结果如下:1.通过Illumina HiSeqTM 2000平台测序,总计产出2,463,507,800 nt数据。组装结果总转录本8,989个,总7,640,353 nt,平均长度850 nt,N50达到1,530 nt。转录本功能注释,注释到NR,Swiss-Prot,KEGG,COG,GO库的转录本分别是5,115个,2,211个,4,486个,2,901个,3,755个,所有注释上的转录本是5,140个。预测得到的的CDS有12,087个。SSR共17个。运用荧光定量PCR技术对转录组中的部分数据重新进行检测,检测结果与转录组测序结果基本一致,证明转录组测序数据准确可信。2.根据Unigenes在KEGG数据库的注释可知,4486个Unigenes被注释到KEGG数据库,并定位到183条代谢通路中,在183个代谢通路中有20个代谢途径与磷代谢相关。根据差异基因表达分析可知,共鉴定出差异基因687个,上调基因421个(61.28%)参与130条代谢通路,且大都集中在氨基酸生物合成、TCA循环、碳代谢、脂代谢及糖代谢等代谢通路中。这些差异表达的基因反映了菌株wj1在外界磷胁迫下的代谢过程和调节途径。3.对wj1转录组的分析过程中发现了磷胁迫处理后基因表达发生明显差异的基因,克隆得到该基因,命名为IMP,大小为885 bp,与转录组测序序列相似性为99.89%。定量分析其在难溶性磷酸盐条件下处于高表达状态。说明IMP基因在溶解难溶性磷方面发挥了一定的作用。将IMP基因与表达载体PGEX-4T-1连接,转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,经SDS-PAGE蛋白电泳检测其融合蛋白大小为56 KDa。对IMP基因酶活测定方法的摸索,根据植酸酶酶活测定方法进行IMP酶活的测定。BL21(PGEX-4T-1-IMP)菌株IMP酶活4 h内随时间的增加而增加,酶活的变化呈显著性差异,在4 h时酶活达到最大为543.48 U·mg-1。4.对IMP基因自身参与的磷脂酰肌醇信号通路中磷脂酶C(PLC)、蛋白激酶C(PKC)及细菌自身形成的磷代谢系统PhoR/PhoB双组份系统中PhoB、PhoU、PhoR、Pst B、PstS1、PstS2基因在同样条件下进行定量PCR。以上基因均在难溶性磷酸盐为唯一磷源培养条件下高表达,说明IMP基因与上述两个通路中各基因均在低磷条件下被激活,处于高表达状态,也说明细菌中多个系统共同参与磷的代谢调控,PI信号通路及PhoR/PhoB双组份系统协同调节。