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第一部分梗死后心肌纤维化与DNA甲基化修饰相关目的:构建梗死后心肌纤维化模型,探讨梗死后心肌纤维化与DNA甲基化修饰之间的关系。方法:健康雄性Sprague Dawley大鼠随机分为心梗模型(MI)组及假手术(Sham)组,分别通过左冠状动脉结扎术或假手术构建模型,术后6周通过H&E染色及Masson染色明确纤维化面积大小,通过q PCR、ELISA以及免疫组织荧光等方法检测纤维化相关因子的表达;通过免疫荧光技术,检测纤维化组织中的细胞增殖情况;通过q PCR以及western blot检测纤维化组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)以及三种亚型DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)基因表达情况;通过DNA甲基转移酶总活性检测试剂盒检测细胞中DNMTs的总活性,初步探讨梗死后心肌纤维化与DNA甲基化修饰之间的关系。结果:与Sham组相比,MI组外周血中I型前胶原羧基端原肽(Procollagen I Cterminal Propeptide,PICP)以及相应左室组织中纤维化相关分子的表达显著上调;H&E染色及Masson染色提示MI组大鼠左室心肌细胞排列紊乱、室壁变薄,且出现显著的胶原沉积;同时,MI组左室组织中DNMTs总活性受到明显抑制,其中DNMT1的表达显著下调。结论:梗死后心肌纤维化与DNA甲基化修饰相关。第二部分DNA甲基化修饰参与心脏成纤维细胞的分化及增殖过程目的:探讨DNA甲基化修饰在转化生长因子β1(Transforming growth factorβ1,TGF-βl)诱导心脏成纤维细胞(Cardiac fibroblasts,CFs)分化增殖并表达α-SMA过程中的调控机制。方法:分离培养原代CFs并进行细胞免疫荧光鉴定,以TGF-βl诱导其分化。构建过表达DNMT1质粒(pc DNA-DNMT1)以及敲低DNMT1的小干扰RNA(si DNMT1)分别干预CFs,通过q PCR以及western blot检测α-SMA以及DNMTs的基因表达情况;通过亚硫酸氢盐基因组测序测定α-SMA基因启动子区相关Cp G位点的DNA甲基化水平;通过CCK-8以及Ed U检测试剂盒检测CFs的增殖能力,初步探讨DNA甲基化修饰在TGF-βl诱导CFs增殖分化过程中的调控机制。结果:(1)与对照组相比,TGF-β1干预后CFs中α-SMA的表达升高,而DNMT1的表达显著下调;(2)在CFs中,DNMT1可调控α-SMA的表达,过表达DNMT1可逆转TGF-β1上调α-SMA的效应,而敲低DNMT1则可使TGF-β1干预后α-SMA的表达水平进一步增加。(3)与对照组(37.5%)相比,TGF-β1干预组(12.5%)α-SMA启动子区Cp G岛甲基化水平明显降低,而过表达DNMT1可逆转TGF-β1干预后带来的α-SMA启动子区Cp G岛甲基化水平降低的效应(33.3%);(4)TGF-β1通过影响DNMT1介导心脏成纤维细胞增殖过程。结论:TGF-β1通过下调DNMT1介导α-SMA启动子区CpG岛甲基化水平,从而影响α-SMA的表达水平,在CFs增殖分化过程中起到作用。第三部分TGF-β1通过Smad以及MAPK信号通路调控心脏成纤维细胞的增殖与分化目的:研究Smad信号通路及丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路对TGF-β1/DNMT1/α-SMA调控网络的影响,以及在心脏成纤维细胞的增殖与分化中的作用。方法:以TGF-β1干预CFs,western blot检测Smad2/3、JNK、ERK、p38以及其各自磷酸化蛋白的表达水平;TGF-β1联合Smad及MAPK信号通路抑制剂(pSmad2/3抑制剂SB431542、p-JNK抑制剂SP600125、p-ERK抑制剂AZD6244及p-p38抑制剂SB203580)干预CFs,western blot检测DNMT1、α-SMA、Smad2/3、JNK、ERK、p38以及其磷酸化蛋白的表达水平;CCK-8、Ed U细胞增殖检测试剂盒检测以上不同干预下CFs增殖情况。结果:(1)与对照组相比,TGF-β1干预组Smad2/3、JNK、ERK、p38蛋白水平无明显改变,而其各自磷酸化蛋白的表达水平明显增加;(2)与TGF-β1干预组相比,TGF-β1联合p-Smad2/3抑制剂/p-JNK抑制剂/p-ERK抑制剂/p-p38抑制剂组均出现DNMT1表达上调及α-SMA表达下调;(3)与TGF-β1干预组相比,TGF-β1联合p-Smad2/3抑制剂/p-JNK抑制剂/p-ERK抑制剂/p-p38抑制剂组均出现CFs增殖减少。结论:TGF-β1可通过Smad以及MAPK信号通路调控DNMT1/α-SMA的表达水平,参与CFs增殖分化过程。