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石上柏是一种常用中草药及我国南方多民族用药,为卷柏科卷柏属植物深绿卷柏Selaginella doederlernii Hieron.的干燥全草,多省(区)、市地方中药材标准均有收载。该品种具有清热解毒、抗癌等功效,常用于治疗咽喉肿痛、呼吸道炎症、湿热黄疸以及肺癌、鼻咽癌、喉癌、肝癌等多种癌症。课题组前期实地调查及初步药理研究发现,石上柏的抗喉癌作用显著,其乙酸乙酯部位活性最强。在此基础上,笔者对石上柏乙酸乙酯萃取部位体外抑制人喉癌Hep-2细胞增殖的作用及机制进行了初步研究探索,并对该有效部位进行了化学成分的分离纯化,进一步研究探索了其药理作用的化学物质基础;还通过紫外-可见分光光度法(UV-Vis)和高效液相色谱法(HPLC)测定了石上柏及同属的另外5种植物药中活性物质黄酮类成分的含量,为它们的质量评价及质量控制提供了可靠的分析方法,并初步确定了其中5种植物药的最佳采收期。本研究采用四氮唑盐还原法(MTT法)、细胞形态学观察法、流式细胞术及免疫印迹法(Western blot)初步探讨石上柏乙酸乙酯萃取部位(SDO-Et OAC)对人喉癌Hep-2细胞的抗肿瘤活性及其机制。结果表明,SDO-Et OAC可明显抑制Hep-2细胞的体外增殖,并呈现剂量和时间双重依赖性;倒置显微镜下观察可发现细胞凋亡的形态学变化,如边缘不规则,贴壁能力下降,染色质固缩等;流式细胞仪检测结果表明,SDO-Et OAC可使Hep-2细胞周期阻滞于S期,从而诱导细胞发生凋亡,且凋亡率随着给药浓度的升高而增加;Western blot法检测相关蛋白的表达发现,随着给药剂量的逐渐增加,Bax、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达量增加,而Bcl-2则减少,表明其凋亡机制可能与上调Bax、下调Bcl-2蛋白表达量,从而降低Bcl-2/Bax蛋白表达比例,以及激活Caspase-9、Caspase-3有关。利用柱层析、半制备高效液相色谱等分离纯化手段对石上柏乙酸乙酯部位的黄酮类成分进行研究,共分离得到9个化合物,根据化合物的理化性质及波谱特征,鉴定其中6个化合物为:7,4′,7′′,4′′′-四甲氧基穗花杉双黄酮(1),橡胶树双黄酮(2),2′′,3′′-dihydroochnaflavone(3),chrysocauloflavone I(6),穗花杉双黄酮(7),delicaflavone(9),化合物(3)为首次从石上柏中分离得到。这些研究结果为后续的具体双黄酮化合物的抗肿瘤活性研究、进一步明确石上柏的药效物质基础奠定了基础。采用UV-Vis法及HPLC法分别测定了石上柏及另外5种卷柏属植物药中总黄酮及穗花杉双黄酮的含量,并比较了不同采收期黄酮类成分的含量变化。结果发现,6种卷柏属植物药中二者含量差异显著;江南卷柏(S.moellendorffii)、薄叶卷柏(S.delicatula)、翠云草(S.uncinata)、疏叶卷柏(S.remotifolia)和异穗卷柏(S.heterostachys)中总黄酮及穗花杉双黄酮的含量在夏秋二季呈现不同的变化趋势。综合考虑后认为薄叶卷柏和异穗卷柏宜于秋季采集,江南卷柏、翠云草和疏叶卷柏在夏秋采集均可。综上所述,本研究从细胞水平初步阐明了石上柏乙酸乙酯萃取部位抗喉癌的作用机制,具体成分的分离及结构鉴定为进一步探索其抗肿瘤作用的药效物质基础打下了一定基础,研究成果还为寻找开发新的抗肿瘤药物资源,以及对石上柏等植物药进行质量控制提供了一定的科学依据。