杂交瘤技术生产的鼠源单抗用于人类疾病的治疗时存在着严重缺陷，最主要的问题是引起人抗鼠抗体(HAMA)免疫应答。为了克服鼠源性单克隆抗体应用于人体时所出现的HAMA反应等问题，人源化抗体应运而生。最早的人源化抗体是将鼠源单抗的可变区和人源抗体的恒定区组成的嵌合抗体，其抗原亲和力保持得很好，同时免疫原性也得到了一定程度的下降。但由于嵌合抗体由于保留了全部的鼠可变区，临床应用时仍可能发生强烈的HAMA反应。为了进一步降低嵌合抗体的免疫原性，人们考虑将鼠互补决定域(CDR)区直接移植到人源抗体可变区中的框架区上，得到CDR移植抗体，也称为人源化抗体。在过去的十年中，人源化抗体的疗效已得到充分的肯定。 CD20抗原是一种B细胞分化抗原，仅位于前B细胞和成熟B细胞，它在95％以上的B细胞性淋巴瘤中表达，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。Rituxan(Rituximab，C288)为美国Genetech公司研制的以人CD20分子为靶点的鼠/人嵌合抗体。Rituxan已于1997年11月获FlDA的批准上市，用于B细胞非霍奇金淋巴瘤的临床治疗。但C288为嵌合抗体，临床上仍有人抗鼠免疫反应产生的报道。为了尽可能降低免疫原性，提高临床使用的安全性，在本研究中，我们拟构建新的抗CD20人源化抗体并对其生物学功能进行鉴定。 我们首先采用传统的杂交瘤技术制备了一株抗人CD20单克隆抗体3D9，流式细胞术的结果表明，与CD20单抗C288对照一样，该抗体都能与表达CD20抗原的Raii细胞特异性结合。我们采用5’RACE技术获得了3D9的可变区全长cDNA，将可变区基因序列输入计算机在GenBank数据库中检索，证明是新克隆的抗体基因。 获得3D9这株单抗的可变区基因之后，我们将它们分别与人源抗体的恒定区连接，然后将嵌合抗体轻、重链基因分别克隆到真核表达载体，最后将嵌合抗体轻、重链表达载体共转染CHO-K1细胞，经选择培养基筛选后获得稳定表达抗体蛋白的CHO细胞克隆。获得的CHO细胞培养上清经Protein A亲和分离纯化获得嵌合抗体C3D9；抗原结合活性结果表明该嵌合抗体能很好地与Raji细胞结合。 为了进一步减小嵌合抗体的免疫原性，我们利用计算机辅助设计对CD20单抗3D9进行人源化改造。在确定了3D9可变区中CDR区和Framework region(FR)区的范围之后，我们将CDR区直接移植到人源抗体模板的FR中，构建CDR移植抗体，并将获得的人源化轻、重链抗体基因克隆到表达载体共转染COS细胞，用流式细胞术测定其抗原结合活性，结果发现这个人源化抗体的亲和力基本完全丧失。为了重建人源化抗体的亲和力，我们利用计算机辅助设计对可能影响抗体亲和力的FR区重要残基进行回复突变分析，分别构建了5条不同的人源化重链和5条不同的人源化轻链，经过活性筛选，我们发现对于人源化重链来说，框架区残基27，30，43，48，67，69，71，73的回复突变是必要的，将它们全部突变为鼠源残基后得到了一个活性几乎等于嵌合抗体重链的人源化重链3D9VHb。我们采用同样的方法对人源化轻链基因进行改造，发现将轻链框架区残基3，4，49全部回复突变获得的人源化轻链3D9VLb与3D9VHb组成的人源化抗体H3D9的抗原结合活性几乎等同于嵌合抗体C3D9，在筛选得到高亲和力的人源化抗体H3D9之后，我们建立了高效表达H3D9的CHO-K1细胞株。竞争抑制实验结果表明此人源化抗体它能与鼠源亲本抗体竞争结合Raii细胞，证实它保留了与鼠源抗体相似的亲和力和特异性，表明H3D9是一个改造成功的人源化抗体。我们进一步对H3D9的体外生物学活性进行了分析，实验结果表明H3D9可有效介导对CD20阳性的人淋巴瘤细胞Dauli和Raji的补体介导的细胞溶解作用(CDC)和抗体依赖细胞介导的细胞杀伤实验(ADCC)作用，并可诱导肿瘤细胞发生凋亡，生存率试验表明抗体组能显著延长小鼠的生存时间。提示它可望发展成为新的非霍奇金淋巴瘤(NHL)的靶向治疗抗体药物。