论文部分内容阅读
目的观察丁苯酞对帕金森病伴抑郁小鼠行为的改善效果和神经元损伤的保护作用,对黑质纹状体区NLRP3炎症小体、小胶质细胞以及相关炎症因子的表达情况的影响,探讨丁苯酞治疗帕金森病伴抑郁的治疗效果及作用机制,为帕金森病伴抑郁的治疗提供新思路。方法C57成年雄性小鼠40只,随机分为正常对照组,帕金森病伴抑郁模型组,美多芭治疗组,丁苯酞联合美多芭治疗组。采用腹腔注射1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）（30mg/kg×7d）建立帕金森病小鼠模型,应用震颤麻痹评分筛选2～3分PD小鼠模型,继续进行慢性不可预知温和应激（21天）制备帕金森病伴抑郁小鼠模型。美多芭治疗组,给予美多芭6.25mg/kg,每天1次,灌胃7天;丁苯酞联合美多芭治疗组,给予美多芭6.25mg/kg和丁苯酞120mg/kg,每天1次,灌胃7天。通过转棒试验、爬杆试验、悬挂试验对小鼠帕金森样行为测试。通过强迫游泳测试、悬尾测试和糖水偏好实验对小鼠的抑郁样行为进行评价。应用蛋白免疫印迹（Western-Blotting）检测黑质纹状体内NLRP3炎症小体、小胶质细胞标志蛋白离子钙结合蛋白1（Ionized calcium binding adaptor,IBA-1）以及相关炎症因子内促炎因子（IL-1β,TNF-α）及抑炎因子（IL-10,Arg-1）蛋白表达量。通过免疫组化定性分析黑质纹状体内NLRP3及a-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）的阳性表达情况。免疫荧光法观察各组小胶质细胞异常激活情况及多巴胺神经元损伤情况。通过实时PCR法检测黑质纹状体组织内促炎因子（IL-1β,TNF-α）及抑炎因子（IL-10,Arg-1）的m RNA相对表达量。研究数据使用SPSS23.0处理,符合正态分布或近似正态分布的计量资料以均数±标准差（（?）±）表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较应用LSD法,以P＜0.05,表示具有统计学差异。结果1行为学实验结果:（1）PD样行为检测结果:与正常对照组比较,模型组转棒实验时间和悬挂实验时间明显减少,爬杆实验时间明显增加增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较,美多芭治疗组及丁苯酞联合美多芭治疗组的转棒实验时间和悬挂实验时间明显增加,爬杆实验时间明显缩短,并且以丁苯酞联合美多芭治疗组更明显,差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）抑郁样行为检测结果:与正常对照组比较,模型组强迫游泳不动时间及悬尾静止时间延长,糖水偏好实验比率降低,差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较,美多芭治疗组及丁苯酞联合美多芭治疗组强迫游泳不动时间及悬尾静止时间减低,糖水偏好实验比率增高,以丁苯酞联合美多芭治疗组更明显,差异有统计学意义（P＜0.05）。2多巴胺能神经元损伤变化:与正常对照组比较,模型组中多巴胺神经元细胞数量明显减少,TH阳性表达程度降低;与模型组比较,丁苯酞联合美多芭治疗组多巴胺神经元细胞数量有所增多,TH阳性表达程度升高。3各组黑质纹状体中α-syn表达结果:与正常对照组比较,模型组α-syn阳性细胞数量明显增多,且着色较深,差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较,丁苯酞联合美多芭治疗组α-syn阳性细胞数量明显减少,染色变浅,差异有统计学意义（P＜0.05）,而单纯帕金森治疗组与模型组比较,差异不显著（P=0.18）。4黑质纹状体中NLRP3的蛋白表达结果:与正常对照组比较,模型组NLRP3蛋白表达量及所见阳性细胞数量明显增多,吸光度值升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较,丁苯酞联合美多芭治疗组NLRP3蛋白表达量及所见阳性细胞数量下降,吸光度值降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较,美多芭治疗组变化不显著（P=0.62）。5黑质纹状体区小胶质细胞标记物IBA-1蛋白表达量和观察小胶质细胞异常激活变化:与正常对照组比较,模型组IBA-1蛋白表达量升高,激活的小胶质细胞数目明显升高,形态胞体变粗,轴突减少,与模型组比较,丁苯酞联合美多芭治疗组IBA-1蛋白表达量升高,活化的小胶质细胞数量明显减少。形态略有恢复,较单纯美多芭治疗组下降明显。6小胶质细胞M1型促炎因子（IL-1β,TNF-α）及M2型抑炎因子（Arg-1,IL-10）的蛋白表达量及m RNA相对表达水平:与正常对照组比较,模型组M1型促炎因子表达均明显升高,M2型抑炎因子表达均下降,差异具有统计学意义（P＜0.05）;与模型组比较,丁苯酞联合美多芭治疗组M1型促炎因子表达量下降,而M2型抑炎因子表达升高,较单纯美多芭治疗组下降明显,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论丁苯酞可改善帕金森病伴抑郁模型小鼠的PD样和抑郁样症状,对神经元有保护作用;其作用机制可能与抑制NLRP3炎症小体的表达及小胶质细胞的激活,抑制炎症因子的表达,减轻炎症反应有关。图 9 幅;表 6 个;参 89 篇。