论文部分内容阅读
叶蝉科昆虫种类丰富,部分叶蝉是小麦兰矮病、枣疯病、玉米鼠耳病、水稻条纹花叶病毒等植物病毒病的传播媒介,严重影响农林业发展,有效防治较为困难,准确鉴定是有效防治的基础。由于该科昆虫体型小,种间形态相似,难以鉴定;传统分类方法对叶蝉卵、若虫及残缺标本,很难做到快速、准确鉴定,便捷高效的DNA条形码技术应运而生,可提高叶蝉鉴定的速率,为叶蝉有效防治奠定基础。帕米尔高原地处中亚东南部,在中国位于新疆西南部,喀什及克州部分地区位于帕米尔高原南麓,与8国接壤或毗邻,随着一带一路发展,贸易往来日益频繁,口岸区域内有害生物传入传出风险日益增加,农林有害生物防控风险加大。但区域内对昆虫研究较少,叶蝉条形码研究鲜有报道,因此开展叶蝉快速鉴定,为有效检测和防治提供依据显得尤为重要。本研究首先通过形态特征分类法,初步确定叶蝉种类,再利用DNA条形码技术,选择mtDNA COI、Cytb及ITS2基因,运用通用PCR扩增技术,借助生物信息学软件对比分析目的基因序列的相似性,结合Genbank数据构建系统进化树、分析遗传距离、获取叶蝉DNA条形码,实现不同种类叶蝉的快速鉴定,以弥补形态学分类的不足,丰富边境地区叶蝉基因数据库,为有效防治提供依据。研究结果如下:1.对28个样本进行形态特征鉴定,得出28个样本属7个亚科、14个属、15种叶蝉。2.本研究获得了66条叶蝉mtDNA基因序列,其中COI基因26条、Cytb基因24条、ITS2基因16条。本研究26个样本COI基因A+T碱基含量平均比例为68.9%,12个样本Cytb基因A+T碱基含量平均比例为71.4%,COI、Cytb基因的A+T含量平均比例高于G+C,存在A/T碱基偏倚,与昆虫线粒体基因碱基构成一致,结果表明,所得COI、Cytb基因序列均能在分子水平上进行检测分析,可作为叶蝉的DNA条形码。3.本研究获得39条新序列,获得Cytb、ITS2基因新序列较多,COI基因新序列较少,其中8条COI新序列,16条Cytb和15条ITS2序列为本区域首次报道。4.本研究通过序列相似性比对、系统进化树、遗传距离分析,对28个样本进行鉴定。mtDNA COI、Cytb及ITS2基因在Gen Bank中最高相似度分别为:100%、99.78%、99.81%,均和叶蝉相关序列的相似性最高。用NJ、ME两种方法构建的COI、Cytb基因分子系统树结构基本一致,本研究的7个亚科、14个属、15种叶蝉在系统发育树上的位置清晰,分类明确,各亚科间、各属、各种在各分类阶元间形成各自独立的单系。15种叶蝉COI基因种间平均遗传距离为0.197,种内平均遗传距离为0.0021,Cytb基因种间平均遗传距离为0.205,种内平均遗传距离为0.0051,种间平均遗传距离均大于2%,种内遗传距离均小于1%,多态位点和遗传距离显示帕米尔高原南麓叶蝉存在显著的遗传分化。基于COI、Cytb基因分析的遗传距离结果一致,且与形态学分类结果一致,将15种叶蝉区分开来,表明帕米尔高原南麓存在条沙叶蝉Psammotettix confinis、大青叶蝉Cicadella viridis、桃一点叶蝉Singapora shinshana、弯茎拟菱纹叶蝉Hishimonoides recurvatis、多态广头叶蝉Macropsis notate、铲头叶蝉Hecalus sp等15种叶蝉。5.本研究基于mtDNACOI、Cytb及ITS2基因序列,对条沙叶蝉、大青叶蝉、铲头叶蝉若虫进行PCR实验,获得这3种叶蝉若虫COI、Cytb及ITS2基因序列,成功对条沙叶蝉、大青叶蝉、铲头叶蝉若虫进行鉴定。前人对叶蝉若虫研究较少,3种叶蝉若虫DNA条形码在文献中尚无记录。6.样本L由形态特征初步判断属条背叶蝉属Tiaobeinia sp.,其与现存额垠叶蝉族Mukariini条背叶蝉属各种类特征均不相同,且与数据库中已知叶蝉Zygina ordinaria的COI序列最高相似度为94.06%,未达到鉴定标准,在数据库中未找到条背叶蝉属的条形码,无法对比,该样本鉴定为一新种。