背景:2022年3月18号,美国食品药品监督管理局（Food and Drug administration,FDA）正式批准抗LAG3单抗Relatlimab联合抗PD-1单抗Nivolumab用于转移性黑色素瘤的治疗。淋巴细胞活化基因3（Lymphocyte activation gene 3,LAG3）成为继CTLA-4和PD-1/PD-L1后研究之后第三个应用于临床肿瘤治疗的免疫检查点。目前已有23种靶向LAG3的单克隆抗体类免疫抑制剂进入临床试验阶段,并在黑色素瘤、乳腺癌、非小细胞性肺癌（NSCLC）和胃癌等实体瘤治疗中取得显著疗效。前期我们通过噬菌体抗体库技术筛选及工程化改造获得了一株靶向LAG3的高亲和力和高特异性的新型全人源Ig G4单克隆抗体LBL-007,能够有效阻断LAG3与其配体MHC-Ⅱ和LSECtin的结合;在敲入LAG3基因的MC38结肠癌细胞转基因小鼠模型中,该抗体单独使用或联合抗PD-1单抗均能较好的抑制肿瘤生长,但其结合的抗原表位及抗肿瘤作用机制尚不明确。目的:本研究旨在鉴定抗LAG3抗体结合的抗原表位并构建LAG3+Jurkat细胞与肿瘤细胞共培养模型,探讨抗LAG3抗体体外抗肿瘤作用及机制,为其临床应用提供实验依据。方法:通过免疫表位数据库（IEDB）预测LAG3蛋白表位;采用噬菌体展示随机12肽库筛选抗LAG3抗体潜在的结合表位,采用ELISA进行特异性检测,通过DNA测序分析比对获得抗LAG3抗体结合的抗原表位;通过Alpha Fold蛋白结构数据库（Alpha Fold Protein Structure Database）预测表位空间结构及位置,为后续晶体学分析表位关键氨基酸作用机制和抗体改构优化提供参考。另一方面,为探讨抗LAG3抗体体外抗肿瘤作用及机制,使用PHA刺激Jurkat细胞,模拟肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）,通过ELISA检测细胞IL-2的分泌评估细胞活化程度,同时通过FCM法、免疫荧光法和WB法检测活化后的Jurkat细胞LAG3及HGC-27、MGC-803、A549和PC-9肿瘤细胞LAG3配体MHC-Ⅱ和LSECtin的表达水平;构建活化的LAG3+Jurkat细胞与肿瘤细胞共培养模型,CCK-8法评估LAG3+Jurkat细胞杀伤肿瘤细胞的效率及抗LAG3抗体对杀伤效率的影响;ELISA法检测培养上清中IL-2、IL-10和TNF-α的分泌水平;FCM法检测共培养体系中Jurkat细胞的凋亡情况。结果:1.通过IEDB数据库预测得到19个潜在的LAG3蛋白抗原表位。2.通过噬菌体展示随机12肽库筛选初步得到30个阳性噬菌体克隆,经ELISA鉴定及DNA测序分析,在16个特异性阳性克隆中获得12种不同的序列,经序列比对后得到LAG3单抗结合表位可能为77 GHPLA 81。3.通过Alpha Fold蛋白结构数据库发现LBL-007结合表位位于LAG3蛋白胞外段D1结构域“额外环”上,属于MHC-II的结合位点区域。4.2μg/ml PHA刺激48h对Jurkat细胞无明显毒性,且能够活化Jurkat细胞使其分泌IL-2并诱导LAG3持续表达,成功构建LAG3+Jurkat细胞;HGC-27细胞不表达MHC-II和LSECtin,MGC-803和A549细胞显著表达MHC-II但不表达LSECtin,PC-9细胞显著表达LSECtin但不表达MHC-II。5.随着共培养模型中效靶比的增加,LAG3+Jurkat细胞对肿瘤细胞杀伤作用逐渐增强,LAG3抗体能够有效增强Jurkat细胞对MHC-II阳性表达的MGC-803和A549细胞的杀伤。6.LAG3抗体能够有效促进共培养体系中IL-2、IL-10和TNF-α的分泌。7.LAG抗体能够抑制共培养体系中Jurkat细胞的凋亡。结论:利用IEDB数据库预测和噬菌体随机12肽库筛选,得到可能的抗LAG3抗体结合抗原表位,并通过蛋白结构预测得到表位的空间结构和位置,为晶体学分析提供参考。另一方面,成功构建LAG3+Jurkat细胞与肿瘤细胞体外共培养模型,抗LAG3抗体通过阻断LAG3/MHC-Ⅱ相互作用恢复LAG3+Jurkat细胞对肿瘤细胞MGC-803和A549的杀伤作用,并且这可能与共培养上清中细胞因子IL-2、IL-10和TNF-α分泌水平升高和抑制Jurkat细胞凋亡有关,为新型全人源LAG3单抗临床应用提供实验依据。