AngⅡ通过上调Cx43活化NF-κB信号通路诱导巨噬细胞M1型极化的作用研究

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目的:本研究通过运用血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)干预RAW264.7小鼠单核巨噬细胞模拟慢性炎症,同时给予Cx43的特异性阻断剂Gap26/Gap19以及NF-κB(p65)信号通路抑制剂BAY117028,探究连接蛋白43(Cx43)及NF-κB信号通路在AngⅡ诱导的RAW264.7小鼠单核巨噬细胞M1型极化中的作用机制。方法:将RAW264.7小鼠单核巨噬细胞分为control组、AngⅡ(10-6mol/L孵育12h)处理组、Gap26预处理组(10-5 mol/L Gap26预处理30 min后加入10-6 mol/L的AngⅡ孵育12 h)、Gap19预处理组(10-5 mol/L Gap19预处理30 min后加入10-6 mol/L的AngⅡ孵育12 h)。运用流式细胞术检测巨噬细胞M1/M2型标记物CD86/CD206的表达频率;运用免疫荧光观察Cx43及巨噬细胞M1型标记物i NOS、CD86的定位及表达,运用q-PCR检测巨噬细胞M1型标记物i NOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、CD86的m RNA表达;运用Western Blot法检测巨噬细胞Cx43,M1型标记物i NOS、CD86及p65磷酸化蛋白的表达;运用ELISA法检测巨噬细胞上清液中细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)。结果:(1)探究不同浓度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)的AngⅡ对巨噬细胞的活性影响,运用CCK-8法检测时发现AngⅡ药物浓度为10-6mol/L时对细胞活性影响最小。(2)AngⅡ可以诱导RAW264.7小鼠单核巨噬细胞向M1型极化。流式细胞术检测了M1型标记物CD86,M2型标记物CD206的表达频率。干预24h后AngⅡ组中的M1型标记物CD86的表达频率和较control组有明显升高(P<0.01);AngⅡ组中的M2型标记物CD206的表达频率较control组变化无统计学差异。Western-Blot结果显示巨噬细胞M1型标记物CD86、i NOS的蛋白表达具有时间依赖性,并在AngⅡ干预12h后表达量到达峰值(P<0.01),随后CD86、i NOS的蛋白表达反而出现下降;M2型标记物CD206的蛋白表达较control组变化无统计学差异。(3)AngⅡ可以上调RAW264.7小鼠单核巨噬细胞上的Cx43。免疫荧光法检测RAW264.7小鼠单核巨噬细胞上Cx43的表达及定位,Cx43定位在细胞膜。Western-Blot技术检测RAW264.7小鼠单核巨噬细胞上Cx43蛋白表达具有时间依赖性,AngⅡ干预12h后蛋白表达量到达峰值(P<0.01)。(4)给予Cx43的特异性阻断剂Gap26/Gap19预处理后,M1型相关指标i NOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、CD86被抑制。q RT-PCR结果显示,AngⅡ干预巨噬细胞12 h后,RAW264.7小鼠单核巨噬细胞上M1型标志的的m RNA较control组(均明显增加(P<0.01),给予Gap26预处理30min后M1型极化指标被抑制(P<0.01);给予Gap19预处理30min后,同样可抑制巨噬细胞M1型极化指标(P<0.01)。Western-Blot和免疫荧光法检测小鼠单核巨噬细胞M1型标记物i NOS、CD86的定位及表达,免疫荧光定位i NOS在全细胞都有表达,CD86主要表达在细胞膜上。ELISA检测RAW264.7小鼠单核巨噬细胞上清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平变化,AngⅡ组的TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平较control组明显升高(P<0.01);给予Gap26、Gap19预处理后,M1型极化指标被抑制(P<0.01)。(5)AngⅡ激活Cx43介导的NF-κB(p65)信号通路。与control组相比,AngⅡ组的p65磷酸化蛋白p-p65蛋白显著上调(P<0.01),表明NF-κB(p65)信号通路被AngⅡ激活。为了探究Cx43与NF-κB(p65)信号通路的关系,我们使用Cx43特异性阻断剂Gap26/Gap19预处理30min后,再用AngⅡ干预巨噬细胞,Western-Blot结果显示AngⅡ+Gap26组和AngⅡ+Gap19组的p65磷酸化蛋白水平比AngⅡ组降低明显(P<0.01),证明AngⅡ激活NF-κB(p65)信号通路依赖于Cx43。(6)AngⅡ诱导RAW264.7小鼠单核巨噬细胞通过活化NF-κB(p65)信号通路向M1型极化,给与NF-κB(p65)信号通路抑制剂BAY117082可以抑制M1型极化指标。q RT-PCR法检测小鼠单核巨噬细胞M1型标记物i NOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、CD86的m RNA表达,AngⅡ组较control组明显升高(P<0.01),给予抑制剂BAY117082预处理后,M1型极化相关指标显著被抑制(P<0.01)。Western-Blot法检测小鼠单核巨噬细胞M1型标记物i NOS、CD86的蛋白表达,ELISA检测RAW264.7小鼠单核巨噬细胞上清中M1型标记物TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白水平变化,给予抑制剂BAY117082预处理后,M1型指标被抑制(P<0.01)。结论:1.AngⅡ通过上调Cx43活化NF-kB(p65)信号通路诱导巨噬细胞M1型极化;2.Cx43的特异性阻断剂Gap26/Gap19对AngⅡ诱导的M1型极化指标具有抑制作用。
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