随着生活水平的提高，心血管疾病已经成为威胁人类健康和生命的主要杀手。长时间的心肌缺血可使组织损伤甚至细胞死亡，解决缺血损伤的关键是冠状动脉再通，但是长时间的心肌缺血后的再灌注往往会导致更严重的损伤，这种现象称之为心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤。缺血再灌注损伤是冠状动脉再通术如溶栓、PTCA或搭桥术后重要的并发症。如何既能保证恢复缺血组织的血流灌注，同时又能减轻I/R损伤的发生成为了目前研究的热点问题。1986年，Murry提出缺血预适应（ischemic preconditioning, IPC）的概念，即在对心肌进行长时间缺血前，先对心肌进行几次短暂性的缺血，心肌可耐受此后更长时间的缺血现象。然而，由于IPC潜在的危险性及在临床实际中的不可操控性，使得IPC的临床应用受到局限。随后研究人员发现多种药物可以模拟IPC产生确切的心肌保护效应，如：挥发性麻醉药七氟烷、阿片类镇静药、他汀类药物等，即药物预处理。由于药物预处理可扩大使用范围，节省处理时间，更适于临床应用。他汀类药物是动脉粥样硬化治疗过程中最重要的药物。研究表明，长期使用他汀类药物的患者不仅能改善远期预后，还可降低PCI术后心肌损伤标志物升高的水平。近2年的临床随机对照试验进一步表明，PCI手术前24小时给予1次较大剂量的他汀类药物（无论是否正在应用他汀类药物）可明显降低PCI术后心肌损伤标志物的升高。他汀类药物的这种即时心肌保护作用很可能是通过药物模拟的缺血预适应实现的，如果这个假设成立，那么应该一个剂量的他汀类药物即可出现心肌保护效果。在本研究中，我们拟建立在体大鼠I/R、离体大鼠I/R及原代培养心肌细胞氧糖剥夺再灌注（oxygen-glucosedeprivation/reperfusion, OGD/R）模型，明确单次负荷量阿托伐他汀（atorvastatin,Ator）预处理对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，并进一步探讨Ator心肌保护的可能机制。通过以上研究，进一步为Ator防治心肌缺血再灌注损伤提供实验依据，并且为临床心肌保护提供新的治疗途径。实验内容主要包括以下三部分：第一部分单次负荷量阿托伐他汀预处理对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响目的：研究单次负荷量阿托伐他汀预处理是否能够模拟缺血预适应对在体大鼠心肌缺血再灌注损伤发挥心肌保护作用。方法：56只健康雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠随机分为8组，每组7只，其中每组中1只用于留取心肌组织的电镜标本。制备阿托伐他汀生理盐水混悬液（20mg/ml），按照80mg/kg灌胃，每只大鼠约需1.0ml。（1）假手术组（sham组）：等量生理盐水灌胃，开胸暴露心脏，于左心耳与主动脉之间找到前降支，于距前降支起点2-3mm处穿线，不结扎前降支；（2）缺血再灌注组（I/R组）：等量生理盐水灌胃，开胸暴露心脏，于前降支近端同一部位处采用套管法完全阻断前降支血流30min，随后再恢复前降支血流灌注120min；（3）缺血预适应组（IPC组）：等量生理盐水灌胃，缺血再灌注前，给予同部位阻断前降支5min，复灌5min，循环3次，再次阻断前降支血流，缺血30min，复灌120min；（4）阿托伐他汀预处理组(Ator组)：术前给予Ator80mg/kg灌胃，分别于灌胃后3h、6h、12h、24h、48h时结扎前降支，缺血30min，再灌注120min，最终选取不同时间点中心肌梗死面积最小组作为Ator预处理组。本实验采用在体大鼠心脏开胸暴露冠状动脉的前降支，并于前降支近端穿线结扎前降支30min，再灌注120min的方法制备在体大鼠I/R模型；采用缺血5min，复灌5min，反复循环3次，制备IPC模型。采用伊文思蓝（Evans Blue）标记心肌缺血范围，以2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride, TTC）标记心肌梗死范围，并采用面积计算法计算心肌缺血区和心肌梗死区的范围；于再灌注120min结束时，于肺动脉取血1-2ml，离心，光化学法测定乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）的活性；透射电子显微镜观察不同处理组心肌细胞超微结构及线粒体损伤程度。结果：1心电图ST-T变化情况I/R组结扎前降支后心电图ST段弓背向上抬高，与T波融合，呈墓碑样改变。Sham组手术前后心电图无明显变化。2I/R组与Ator预处理各组梗死面积的比较与I/R组相比，Ator6组、Ator12组、Ator24组、Ator48组的心肌梗死面积显著减少（P＜0.05），其中Ator12组较Ator48组心肌梗死面积显著减少（P＜0.05），较Ator6组、Ator24组心肌梗死面积有减少趋势，但无统计学差异（P＞0.05）；Ator3组的心肌梗死面积与I/R组比较未见统计学差异（P＞0.05）。依据上述实验结果，最终选择Ator12组作为Ator预处理组。3各组心肌缺血范围的比较缺血区范围用缺血区（area at risk）与左心室（left ventricular）面积比来测定。用AAR/LV表示缺血区与左心室面积比。与I/R组相比，IPC组、Ator组的缺血区范围（AAR/LV）显著减少（P＜0.05）；与IPC组相比，Ator组的缺血范围有增大趋势，但未见统计学差异（P＞0.05）。4各组心肌梗死范围的比较梗死范围大小用心肌梗死区（infarct area）与缺血区（area at risk）面积比来表示。用IA/AAR表示梗死区/与缺血区面积比。与I/R组相比，IPC组、Ator组的梗死区范围（IA/AAR）显著减少（P＜0.05）；IPC组与Ator组的梗死区范围相比无统计学差异（P＞0.05）。5各组LDH活性的比较与I/R组相比，IPC组、Ator组的LDH的活性均显著下降（P＜0.05）；与IPC组相比，Ator组的LDH活性显著增加（P＜0.05）。6各组心肌超微结构的改变Sham组心肌组织结构及线粒体等超微结构正常，肌原纤维与嵴突排列整齐，线粒体多而密集，糖原颗粒丰富；I/R组肌原纤维重度水肿，结构紊乱，线粒体肿胀明显、膜完整性丧失，糖原颗粒减少；IPC组心肌组织较I/R组损伤明显减轻，肌原纤维肿胀不明显，肌膜遭到破坏，线粒体结构基本正常且密集分布，嵴突数目较多，糖原颗粒较丰富；Ator组心肌细胞轻中度水肿，肌膜肿胀较轻，部分肌原纤维及肌丝排列不规则，线粒体总体结构尚可，轻度水肿，嵴突数目变少、排列紊乱，糖原颗粒较多。结论：1单次负荷量Ator（80mg/kg）预处理能够减轻在体大鼠心肌缺血再灌注损伤，其最大保护作用出现于灌胃后12小时左右。2在心肌缺血再灌注损伤保护作用方面，单次负荷量Ator预处理并不优于缺血预适应。第二部分阿托伐他汀预处理对离体大鼠心脏缺血再灌注损伤的保护作用及其作用机制研究目的：探讨阿托伐他汀预处理对离体大鼠全心缺血再灌注损伤是否具有心肌保护效果及线粒体ATP敏感性钾通道（mitochondrialATP-sensitive potassium channels, mitoKATPchannels）和线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）在其中的作用。方法：用K-H缓冲液逆行灌流离体SD大鼠心脏，全心缺血30min后复灌120min建立离体缺血再灌注损伤模型。应用mitoKATP通道的阻断剂5-HD (5-hydroxydecanoic acid)或mPTP的开放剂氯尼达明（lonidamine，LND），用以评价mitoKATP通道和mPTP在Ator预处理中的作用。SD大鼠随机分为以下7组：（1）control组：持续灌流。（2）I/R组：心脏进行全心缺血30min，再灌注120min。（3）Ator预处理组：分别于全心缺血前15min，30min，60min或120min灌流Ator（1μM），确定Ator最佳保护用药时间；全心缺血前分别给予Ator0.01μM,0.1μM,1μM,10μM灌流30min（Ator最佳用药时间为30min），确定Ator最佳保护用药浓度。（4）Ator+5-HD组：心脏首先灌流5-HD（100μM）20min，然后全心缺血前预处理Ator（1μM）30min。（5）Ator+LND组：全心缺血前预处理Ator（1μM）30min，在再灌注开始时给予LND（30μM）20min。（6）5-HD组：心脏首先灌流5-HD（100μM）20min，然后全心缺血前灌流K-H缓冲液30min。（7）LND组：在再灌注开始时给予LND（30μM）20min。比较各组间的血流动力学、心肌梗死面积、冠脉流出液中乳酸脱氢酶（LDH）活性及心肌组织ATP含量。再灌注20min后测定心肌烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）含量以反映mPTP的开放情况。透射电子显微镜观察不同处理组心肌细胞超微结构及线粒体损伤程度。结果：1Ator对缺血再灌注后心肌梗死面积的影响与I/R组相比，Ator15，Ator30，Ator60明显减少心肌梗死面积（P＜0.05）。Ator120与I/R组相比无统计学差异（P＞0.05）。与Ator30相比，Ator15，Ator60心肌梗死面积明显增加（P＜0.05），说明Ator最佳保护作用的用药时间为30min。与I/R组相比，四种不同浓度的Ator预处理均明显减少心肌梗死面积（P＜0.05）。其中，1μM的Ator预处理心肌保护作用最佳。5-HD或LND的联合应用取消了Ator减少心肌梗死面积的作用（P＜0.05）。与I/R组比较，单独给予5-HD或LND对心肌梗死面积无明显影响（P＞0.05）2Ator对血流动力学的影响7组离体心脏平衡期血流动力学指标比较没有统计学差异（P＞0.05）。缺血30min，再灌注120min后，心功能指标均较平衡期基础值减退。主要表现在左心室收缩压（LVSP），左心室压力最大变化速率（dp/dtmax，-dp/dtmax）和心率（HR）降低，左心室舒张末压（LVEDP）升高。Ato（r1μM）组血流动力学的各项指标均优于I/R组（P＜0.05）。然而，Ator预处理对心功能的保护作用可被5-HD或LND完全阻断。3Ator对LDH的影响与control组相比，I/R组心脏再灌注后冠脉流出液中LDH活性明显上升（P＜0.05）。Ator预处理可显著降低LDH活性，5-HD或LND与Ator联合应用时，均阻断了Ator降低LDH的作用。与I/R组比较，单独给予5-HD或LND对LDH活性无明显影响（P＞0.05）。4Ator对离体心脏缺血再灌注后心肌内ATP水平的影响与control组相比，I/R组内ATP水平显著降低（P＜0.05）。Ator预处理组较I/R组心肌内ATP水平显著升高（P＜0.05），Ator升高ATP的效果被5-HD或LND所抑制。5Ator对mPTP开放的影响再灌注20min后，control组心肌NAD+含量高于其他组（P＜0.05）。Ator预处理组较I/R组显著升高（P＜0.05），提示Ator预处理通过抑制mPTP的开放而阻止NAD+降低。5-HD与LND单独使用时均不影响心肌NAD+含量（P＞0.05），但是当与Ator联合应用时，5-HD或LND均可消除Ator对mPTP开放的抑制作用。6心肌细胞超微结构的变化与control组相比，I/R组线粒体超微结构发生巨大的变化：肌原纤维粗细不均，肌节结构不清，部分肌丝破坏，溶解。线粒体明显肿胀，内呈空泡状，可见嵴断裂、稀疏，甚至消失。糖原颗粒数量明显减少。Ator预处理明显改善心肌细胞超微结构变化。但是5-HD或LND取消了Ator的保护作用。结论：1阿托伐他汀可不受神经体液因素影响，直接作用于心肌，发挥心肌保护作用。2阿托伐他汀有最佳保护用药浓度，剂量过大，将会产生细胞毒性。3阿托伐他汀的心肌保护作用是通过mitoKATP通道的活化和mPTP开放的抑制介导的，并且mitoKATP通道可能位于mPTP的上游。第三部分阿托伐他汀预处理对原代培养心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤的保护作用及其相关机制的探讨目的：研究阿托伐他汀预处理对原代乳鼠心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤是否具有保护作用及线粒体在其中的作用。方法：从新生SD大鼠分离原代心肌细胞。建立体外缺血再灌注模型，心肌细胞经历氧糖剥夺10h，再灌注3h。新生大鼠心肌细胞随机分为以下7组：（1）control组：细胞在正常条件下培养。（2）OGD/R（oxygen-glucose deprivation/reperfusion）组：细胞经历10h OGD和3h再灌注。（3）Ator组：分别于OGD前预处理Ator1h，3h，6h，12h或24h，确定Ator最佳保护用药时间；OGD前分别预处理Ator（0.01μM,0.1μM,1μM,10μM）3h（Ator最佳用药时间为3h），确定Ator最佳保护用药浓度。（4）Ator+5-HD组：细胞首先预处理5-HD（100μM）20min，然后OGD前预处理Ator（1μM）3h。（5）Ator+LND组：OGD前预处理Ator（1μM）3h，在再灌注开始时给予LND（30μM）20min。（6）5-HD组：细胞首先预处理5-HD（100μM）20min，然后OGD前与普通培养基孵育3h。（7）LND组：在再灌注开始时给予LND（30μM）20min。再灌注3h后，测定MTT和乳酸脱氢酶（LDH）判断细胞损伤程度。再灌注20min后，用激光扫描共聚焦显微镜技术测定mPTP的开放情况，钙浓度，线粒体膜电位。用流式细胞技术及激光扫描共聚焦显微镜技术测定活性氧（ROS）。结果：1Ator预处理对心肌细胞活力的影响与OGD/R组相比，5个不同时间段的Ator预处理均有显著性差异（P＜0.05）。其中Ator预处理3h的心肌保护作用最佳。将此作用时间应用于以下实验方案。与OGD/R组相比，四种不同浓度的Ator预处理均有显著性差异（P＜0.05）。其中，1μM的Ator预处理心肌保护作用最佳。mitoKATP通道的阻断剂5-HD或mPTP的开放剂LND的联合应用取消了Ator增加心肌细胞活力的作用（P＜0.05）。与OGD/R组比较，单独给予5-HD或LND对心肌细胞活力无明显影响（P＞0.05）。2Ator对心肌细胞LDH的影响与control组相比，OGD/R组心肌细胞上清液中LDH水平明显上升（P＜0.05）。Ator预处理组LDH水平较OGD/R组显著降低（P＜0.05）。5-HD或LND与Ator联合应用时，均阻断了Ator降低LDH的作用。3Ator预处理对mPTP开放程度的影响OGD/R组心肌细胞荧光强度较弱，明显低于control组（P＜0.05）。Ator预处理组荧光强度明显高于OGD/R组（P＜0.05）,表明Ator抑制mPTP的开放。5-HD或LND取消了Ator预处理对mPTP开放的抑制作用。5-HD组和LND组的荧光相对值与OGD/R组比较无显著性差异。4Ator预处理对ROS的影响OGD/R组与control组相比，心肌细胞内ROS水平明显升高（P＜0.05）, Ator预处理组心肌细胞ROS水平较OGD/R组下降（P＜0.05）。加入5-HD或LND联合Ator治疗后，心肌细胞内的ROS水平增加，说明5-HD或LND阻断了Ator降低ROS的效果。5Ator预处理对钙浓度的影响OGD/R组荧光强度较control组明显增强（P＜0.05）。Ator预处理组可见荧光强度较OGD/R组明显减弱，表明Ator预处理对OGD/R所致的钙超载有抑制作用，钙超载减轻。此效果可被5-HD或LND所阻断(P<0.05)。6Ator预处理对线粒体膜电位的影响OGD/R组明显的减少了TMRE荧光强度，表明了线粒体膜电位的下降。OGD前给予Ator预处理，明显的抑制了OGD/R所致的TMRE荧光的降低，减少了线粒体膜电位的下降。Ator+5-HD组和Ator+LND组的TMRE荧光强度较Ator组明显减弱，说明5-HD或LND抑制了Ator维持线粒体膜电位的作用。结论：1阿托伐他汀可直接作用于心肌细胞，发挥心肌保护作用。2阿托伐他汀的心肌保护机制可能是通过活化mitoKATP通道，减少氧化应激和钙超载，进而抑制mPTP的开放及线粒体膜电位的去极化。