微拟球藻诱变育种及高脂藻株筛选方法研究

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随着世界经济发展,化石能源消耗日益加剧,环境问题不断凸显。为推进经济社会可持续发展,必须加快转变发展方式、优化能源结构,开发资源节约、环境友好的新型能源。微藻是水域生态系统的初级生产者,具有种类繁多、结构简单、生长迅速以及含油量高等特点,近年来,利用微藻制备生物柴油已成为全世界研究的焦点。但是,由于多方面原因,微藻制备生物柴油至今仍未能实现工业化生产,其制约因素之一是缺乏优良的种质资源。微拟球藻(Nannochloropsisoceanica)生长速度快、油脂含量高、抗逆性强,是极具开发潜力的优良藻种。本文以研究室保存的微拟球藻(N.oceanica)藻种(编号为CS-179)为材料,经过分离纯化开展了诱变育种研究,得出以下结果:1.研究了乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂精喹禾灵筛选高脂微藻的可行性,发现7.5mol/L精喹禾灵可抑制99.7%的微拟球藻生长,10mol/L精喹禾灵完全抑制微拟球藻生长,确定了其有效性。以7.5mol/L精喹禾灵筛选获得两个藻株KA1和KA2,经52天培养后,其总脂含量分别达干重的46.73%和38.60%,比出发藻株分别提高了29.02%和6.57%。KA1的比生长速率和终生物量与出发藻株无显著差异,但其油脂产率比出发藻株显著升高。2.利用浓度为50mM的化学诱变剂甲基磺酸乙酯(EMS)对微拟球藻进行诱变处理,并用精喹禾灵作为筛选压进行高脂诱变藻株筛选,获得了KE75B1和KE10A1两个高脂藻株,其总脂含量分别占细胞干重的44.19%和43.51%,比出发藻株(总脂含量占细胞干重的39.34%)分别提高了12.35%和10.62%(P<0.05),且KE75B1藻株的油脂产率也较出发藻株提高18.07%(P<0.05)。3.探索了尼罗红微波助染法筛选高脂微拟球藻诱变藻株的有效性,结果表明:利用DMSO预处理样品,在微波加热45s和15s时,尼罗红染色的效果最佳。以此方法筛选获得了三株荧光强度较出发藻株显著提高的诱变藻株,经氯仿-甲醇提总脂法进行验证,诱变藻株E232和E234的总脂含量占其细胞干重的百分比分别较出发藻株提高了13.04%和16.39%(P<0.05),诱变藻株E225虽然差异不显著(P>0.05),但也较出发藻株升高了10.78%,证明了该高通量筛选方法的可行性。综上所述,本研究证明了以甲基磺酸乙酯(EMS)进行高脂微拟球藻诱变育种的有效性,确定了精喹禾灵作为筛选压筛选高脂微拟球藻的可行性,探明了尼罗红微波助染高通量筛选高脂微拟球藻的基本条件,为发展微拟球藻诱变育种提供了参考。
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