日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）属于黄病毒科,黄病毒属,是造成亚洲及太平洋地区病毒性脑炎的主要病原之一。本研究以实验室之前工作为基础,旨在构建拯救NS2A-C60A单点突变病毒株,并探究NS2A-C60A点突变病毒相关生物学特性的变化。本研究为深入剖析日本乙型脑炎病毒传代致弱中非结构蛋白表达变化与致弱机制之间的关系以及进一步探讨非结构基因突变在日本乙型脑炎病毒生命周期中可能扮演的角色提供理论基础。1.rSA14-NS2A-C60A单点突变病毒的拯救本研究成功构建拯救出了包含NS2A-C60A单点突变的病毒株r JEV-C60A。首先,通过对JEV致弱株SCYA201201-0901毒株与其原毒株SCYA201201-01进行基因序列测序比对以及结构预测,确定了可能影响JEV神经毒力的位点突变NS2A-C60A;其次,通过致弱株与原毒株接毒HEK-293细胞收集总蛋白进行Western Blot比较验证,发现致弱毒株的NS1’蛋白较原毒株表达下降;最后,利用反向遗传操作技术成功构建拯救r SA14-NS2A-C60A单点突变病毒,并结合细胞病变观察,噬斑试验、PCR检测以及序列测定等方法对拯救的病毒进行了鉴定。2.rJEV-C60A点突变病毒的生物学特性研究本研究证实了NS2A-C60A点突变能影响日本乙型脑炎病毒NS1’蛋白表达,但其对病毒生长特性、噬斑形成及神经毒力未见明显影响。首先,在BHK-21细胞上利用噬斑,生长曲线测定等方法研究了该突变对日本乙型脑炎病毒体外生长特性的影响,发现该目标点突变对JEV的噬斑形成、形态以及生长特性均未产生影响;其次,双荧光素酶分析及Western Blot结果显示该单点突变显著减少了病毒NS1’蛋白的表达（p＜0.5）,说明该位点对于病毒NS1’蛋白的产生至关重要;最后,利用小鼠神经细胞BV-2及小鼠动物模型分别研究了NS2A-C60A突变对日本乙型脑炎病毒诱导炎性因子表达及神经毒力的影响。炎性实验结果显示该点突变病毒r JEV-C60A能够轻微提升炎性因子CCL-2,IL-6及IFN-β的表达水平,但是相比于原毒株并不显著（p＞0.5）;将65只小鼠平均分为13组进行神经毒力实验,每个病毒滴度重复3次进行验证,发现200PFU的未突变病毒与点突变病毒分别引起小鼠的死亡率分别为53.33%与53.33%,而2000PFU的病毒分别引起小鼠的死亡率均为100%。