结直肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一,在欧美国家肿瘤死亡原因的统计中,它是仅次于肺癌的第二大原因,在我国也居于前列,并呈逐年上升的趋势。尽管当前的常规治疗手段一定程度上缓解了患者的痛苦,延长其寿命,但还存在一定的缺陷。对于中晚期结肠癌患者而言手术效果差,且创伤性大,而化学治疗却面临越来越频繁的耐药难题,所以迫切需要发展或联合新的治疗策略。凋亡是生物体内普遍存在的一种生理现象,细胞增殖与凋亡相互平衡才能维持组织器官正常的生理功能和细胞数的稳定,否则可导致肿瘤发生。随着凋亡与肿瘤发生关系的深入研究,已有证据表明细胞凋亡受阻是肿瘤发病和对化疗耐药的重要机制之一。因此,诱导、促进肿瘤细胞凋亡成为治疗肿瘤重要的策略之一。糖皮质激素(glucocorticoid,GC)通过与其特异性受体-糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)结合,不仅可诱导未成熟胸腺细胞凋亡,而且对急性白血病细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞等均有促凋亡作用,诱发凋亡正是应用糖皮质激素治疗白血病的分子生物学基础。糖皮质激素可以诱导血液系统肿瘤细胞发生凋亡,但是其机制仍然不是很清楚。现在认为GC诱导的凋亡依赖于GC与GR的相互作用,肿瘤细胞GR的表达水平是GC敏感与否的关键因素。GC通过与GR相互作用后调节凋亡相关基因的表达,诱导或抑制肿瘤细胞凋亡。这些基因主要有核转录因子NF-κB、AP-1,凋亡相关的BCL-2基因家族、caspases以及具有诱导增殖和凋亡双重作用的c-myc基因等。早在1979年Alford等人在研究中就发现23%结肠癌表达GR,Theocharis等通过免疫组化的方法发现48%的结肠癌组织标本GR表达阳性,并且GR的表达与细胞周期相关分子pRb和CKI(p16)的表达相关。在体外实验中发现地塞米松可使结肠癌细胞系Colo320 HSR细胞出现G1期停滞和使p21/WAF1表达水平升高。但是GC对结直肠癌是否有抗肿瘤效应、能否增加结肠癌化疗的敏感性,目前研究较少而且存在争议。本实验拟检测GR在结肠癌组织、细胞株中的表达,并与淋巴瘤组织表达进行比较;Dex体外应用观察GC对结肠癌细胞和淋巴瘤细胞的敏感性,探讨Dex对5-Fu和L-OHP的化疗敏感性的影响;检测GR亚型、NF-κB活性、IκB及BCL-2的表达在Dex诱导结肠癌细胞和淋巴瘤细胞凋亡过程中的变化,探讨GC在两种肿瘤中作用机制的差异以及GC在结肠癌化疗中的作用及应用可行性。方法1、应用免疫组化的方法检测GR、NF-κB及BCL-2在结肠癌和淋巴瘤组织中的表达,了解GR表达与NF-κB、BCL-2及临床病理参数的关系,比较GR在结肠癌和淋巴瘤中表达的差异。2、以RT-PCR及Western Blotting检测GR在四种结肠癌细胞株中的表达,以5-Aza处理GR阴性的细胞,了解甲基化对GR表达的影响。3、MTT法检测GC对四种结肠癌细胞的毒性作用,以及GC与5-Fu及L-OHP共处理和预处理对结肠癌细胞化疗敏感性的影响。4、应用流式细胞术、Hoechst33342染色、DNA Ladder检测GC诱导结肠癌细胞的凋亡。5、应用RT-PCR及Western Blotting检测GC诱导结肠癌细胞和淋巴瘤细胞株Jurkat凋亡过程中GRα、GRβ、IκB和BCL-2的表达改变,以及NF-κB的活性改变。6、应用RNA干扰技术沉默结肠癌细胞的GRα和GRβ基因表达,观察GR亚型表达对GC诱导细胞凋亡的敏感性的影响。结果1、结肠癌组织标本中GR的阳性率为57.3%,低于淋巴瘤的90%。结肠癌组织GR的表达与肿瘤的分化程度相关(x2检验,p=0.029),分化程度高的GR阳性率高;同时GR表达与NF-κB的表达呈正相关(r = 0. 352, p =0. 005),与BCL-2无关。GR的表达不受患者性别、年龄、肿瘤位置的影响,也与Dukes’分期、淋巴结转移无关。2、在四种结肠癌细胞株中,Lovo和HCT-116表达GR,而HT-29和SW-480为阴性。5-Aza处理可以部分恢复HT-29和SW-480细胞的GR表达,但是MSP-PCR未检测到GR基因启动子甲基化。3、1～3×10-4M的Dex可以抑制GR阳性的Lovo和HCT-116细胞增殖。在Lovo细胞抑制率分别为40.2%、46.9%和52.6%,在HCT-116细胞抑制率为41.8%、49.3%和58.8%,高于1×10-5mol/Ldex处理的低浓度组(p<0.01)。Hoechst33342染色和DNA Ladder检测显示Dex可以诱导Lovo细胞凋亡。流式细胞仪检测经1×10-4mol/L Dex处理72h的Lovo和HCT-116细胞以及未加Dex的对照组细胞,细胞凋亡率分别为处理组Lovo细胞(34.8±1.9)%和HCT-116细胞(33.6±1.4)%以及对照组Lovo(2.9±0.4)%和HCT-116(6.4±1.3)%。处理组凋亡率明显高于对照组(p<0.01)。即使经1×10-4mol/L Dex诱导72小时的HT-29和SW-480细胞,凋亡率也较低。而同时以1×10-5mol/L的Dex诱导Jurkat细胞36小时,其凋亡率(50.3±2.4)%也高于结肠癌细胞。4、1×10-4mol/L的Dex预处理Lovo细胞24小时,或与5-Fu共处理可以使5-Fu的IC50从72.2±8.1μg/ml降低至21.1±4.1μg/ml和18.6±4.0μg/ml;而对L-OHP则可以使其IC50从13.7±1.3μg/ml降低至5.9±0.6μg/ml和4.8±0.7μg/ml。5、Dex处理Lovo和Jurkat细胞,在6、12和24小时两个细胞均出现NF-κB活性降低,GRα和IκB的mRNA和蛋白表达升高,而BCL-2在两个细胞中的表达无明显改变;在Lovo细胞中,Dex处理6小时后出现GRβ的mRNA表达明显升高;而在Jurkat细胞,GRβ的表达无明显改变。6、转染GRαRNAi2干扰载体的Lovo细胞,其GRα的mRNA和蛋白表达分别下降73.7%和59%,Dex诱导的细胞凋亡率则从(22.8±2.5)%下降至(6.5±04.5)%,两者差异显著(t=29.06,p <0.01)。转染GRβ的小分子干扰片断后,Lovo细胞GRβ的mRNA表达下降67.3%,Dex诱导的细胞凋亡率则从(34.7±1.8)%上升至(45.4±4.3)% (p<0.05)。结论1、GR在结肠癌组织中表达,阳性率为57.3%,但远低于在淋巴瘤中的表达;结肠癌组织GR的表达与肿瘤的分化程度以及NF-κB的表达相关,与BCL-2表达、Duke’s分期、淋巴结转移以及患者性别、年龄、肿瘤位置的影响无关。2、GR在结肠癌细胞株的表达可能与GR基因启动子甲基化无关,而很可能是其上游调控基因甲基化影响了GR的表达。3、Dex可以诱导GR阳性的结肠癌细胞株发生增殖抑制和凋亡,但其敏感性远低于淋巴瘤Jurkat细胞株。4、Dex共处理和预处理24小时可以增加Lovo细胞对5-Fu和L-OHP的化疗敏感性。5、NF-κB活性降低、GRα和IκB的表达增加可能是Dex诱导结肠癌细胞和淋巴瘤细胞凋亡的共同机制;而GRβ的表达升高则可能是结肠癌细胞对Dex的敏感性低于淋巴瘤Jurkat细胞的原因之一。