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雄性动物睾丸的大小可在一定程度上影响其射精量以及精子发生的有序进行,对雄性动物的繁殖能力具有重要的作用。microRNA(miRNA)是一类调节转录后水平基因表达的内源性非编码RNA,在睾丸发育和精子发生过程中起重要调节作用。本课题组前期采用RNA-seq技术在不同发育阶段的猪睾丸组织中鉴定出374个miRNA,发现miR-499在沙子岭猪性成熟前后的睾丸组织中差异表达。本研究综合利用多种分子实验技术于细胞水平研究了miR-499及其靶基因PTEN通过PI3K/AKT信号通路对猪未成熟支持细胞增殖和凋亡的作用,以期为提高雄性动物的繁殖能力提供理论依据。研究结果如下:(1)miR-499靶向调控PTEN基因在猪未成熟支持细胞中的表达根据miR-499靶基因预测信息,构建了pmirGLO-PTEN-3′UTR-WT/MUT载体,并与miR-499 mimic和mimic NC进行猪未成熟支持细胞的共转染,检测荧光素酶活性。结果显示,miR-499 mimic+pmirGLO-PTEN-3′UTR-WT共转染组的荧光活性极显著低于其它三组(P<0.01),表明miR-499可靶向PTEN 3′UTR区预测结合位点。随后,分别过表达和抑制表达miR-499于猪未成熟支持细胞,实时荧光定量PCR和Western Blot技术检测了PTEN基因在各组细胞中的表达,结果表明:过表达miR-499后,PTEN基因表达水平显著降低(P<0.05),而抑制表达miR-499后,PTEN基因表达水平显著增加(P<0.05)。(2)miR-499和PTEN基因对猪未成熟支持细胞生长的影响为明确miR-499和PTEN基因的功能,分别过表达或抑制表达miR-499和PTEN基因于猪未成熟支持细胞,采用CCK8和EdU试剂盒检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期情况和细胞凋亡率,ATP试剂盒检测细胞ATP水平,实时荧光定量PCR和Western Blot技术检测细胞周期、凋亡和PI3K/AKT信号通路相关基因的表达。结果显示,过表达miR-499后,猪未成熟支持细胞的增殖得到促进;猪未成熟支持细胞G1期的细胞比例降低,S期的细胞比例增加,周期相关基因C-MYC、CCNE1、CCND1和CDK4的表达升高;猪未成熟支持细胞的凋亡比例降低,促凋亡相关基因Bax、Casepase-3的mRNA和蛋白表达降低,抑凋亡相关基因Bcl-2的mRNA和蛋白表达以及细胞内ATP水平均升高;猪未成熟支持细胞内PI3K和AKT磷酸化蛋白的表达升高。干扰PTEN基因的实验结果与过表达miR-499的结果一致,而抑制表达miR-499的结果与之相反。(3)miR-499靶向PTEN基因对猪未成熟支持细胞生长的影响为进一步明确miR-499通过靶向PTEN基因调控猪未成熟支持细胞生长,本研究设计了3组共转染实验,分别为:miR-499 inhibitor+siRNA PTEN、miR-499 inhibitor+siRNA NC和inhibitor NC+siRNA NC,利用上述多种实验方法检测其对猪未成熟支持细胞的功能。结果显示,转染miR-499 inhibitor+siRNA PTEN组,能够促进猪未成熟支持细胞的增殖;猪未成熟支持细胞G1期的细胞比例降低,S期的细胞比例增加,周期相关基因C-MYC、CCNE1、CCND1和CDK4的表达升高;猪未成熟支持细胞的凋亡比例降低,促凋亡相关基因Bax、Casepase-3的mRNA和蛋白表达降低,抑凋亡相关基因Bcl-2的mRNA和蛋白表达升高;猪未成熟支持细胞内PI3K和AKT磷酸化蛋白的表达升高。而转染miR-499 inhibitor+siRNA NC组,结果与转染miR-499 inhibitor+siRNA PTEN组相反。综上所述,miR-499靶向PTEN基因通过激活PI3K/AKT信号通路促进猪未成熟支持细胞增殖而抑制其凋亡。