丹参(Salvia miltiorrhiza)是唇形科鼠尾草属植物,是我国传统中药,其根中所含酚酸类和丹参酮类化合物是主要的药理活性成分。鼠尾草属是唇形科最大的一个属,全国有约84种,多分布于西南地区,多种鼠尾草被证实含有与丹参相近的成分,例如甘西鼠尾草(Salvia przewalskii)、绒毛鼠尾草(Salvia castanea Diels f.tomentosa Stib.)、云南丹参(Salvia yunnanensis)等,在许多地方作为丹参替代品入药,对丹参原料药材的流通和应用产生一定影响。本研究针对不同来源丹参及其近缘种进行深入研究,揭示有效成分的组成差异、影响因素等,通过评价丹参近缘种的生物活性及其与丹参的亲缘关系,为合理开发和利用相关近缘种提供理论依据。本研究主要内容如下:1.通过收集六个种质的丹参和八个种质的鼠尾草,比较不同生长时期不同部位有效成分的种类和含量变化,发现绒毛鼠尾草、甘西鼠尾草根中含大量丹参酮类化合物,丹参酮IIA含量超过丹参,且随生长时期变化呈现出逐渐上升的趋势。不同鼠尾草叶片富含酚酸类化合物,绒毛鼠尾草、甘西鼠尾草、撒尔维亚叶片迷迭香酸含量丰富,而丹酚酸B在鼠尾草各个部位含量很低或未检出。不同丹参根冠比随生长时间呈现逐渐升高的趋势,采收期均获得大量鲜根;不同鼠尾草不同生长期根冠比变化不明显。通过比较不同丹参及近缘种酚酸代谢途径两个关键酶:苯丙氨酸解氨酶和酪氨酸氨基转移酶活性,不同来源丹参两种酶活性高于鼠尾草,这与丹参体内积累大量迷迭香酸和丹酚酸B有关。绒毛鼠尾草、甘西鼠尾草两种酶活高于其他鼠尾草,这可能与二者体内迷迭香酸等酚酸化合物含量高于其他鼠尾草有关。最终表明,不同生长期丹参及其近缘种有效成分的种类和积累规律呈现多样化。2.对西藏芒康、四川理塘、陕西商洛和陕西杨凌四个产地的甘西鼠尾草有效成分进行HPLC分析,比较不同材料根和叶片中酚酸类和丹参酮化合物含量,并分析不同产地土壤元素的组成,利用相关性分析得到有效成分与土壤元素水平的关系,结果表明:芒康、理塘野生甘西鼠尾草根中阿魏酸含量低于陕西商洛和杨凌材料,杨凌栽培型材料阿魏酸含量最高达4.25±0.36 mg·g-1(dry weight,DW)。叶片中咖啡酸含量呈相反趋势,芒康、理塘野生甘西鼠尾草其含量高于栽培种,最高为0.64 mg·g-1 DW。栽培型甘西鼠尾草根中迷迭香酸含量高于野生型,而野生型叶片中其含量明显高于栽培型。芒康、理塘野生材料丹参酮IIA含量高于两个栽培型,最高达24.67 mg·g-1 DW,是药典规定丹参中丹参酮IIA含量的12.3倍,根中隐丹参酮含量亦较高。除二氢丹参酮外,不同产地甘西鼠尾草叶片则几乎不含其他丹参酮类化合物。相关性分析表明,不同产地甘西鼠尾草根中迷迭香酸等化合物含量与土壤中钾、钙元素水平呈显著正相关(P<0.05);根中丹参酮类化合物与Mn元素含量呈显著负相关(P<0.05)。说明不同来源甘西鼠尾草不同部位有效成分差异显著,受环境因素尤其是土壤元素组成的影响明显。3.利用目标起始密码子多态性(start codon targeted polymorphism,SCo T)分子标记和DNA条形码(叶绿体基因组psb K–psb I intergenic spacer)对不同来源丹参及鼠尾草进行遗传多样性分析,分别利用UPGMA(unweighted pair group method analysis)法和邻接法(neighbor-joining,NJ)对SCo T扩增片段和psb K–psb I条形码碱基序列进行分析,构建系统进化树,两种方法得到相近的结果。不同来源丹参聚成一类,表现出相近的遗传背景;不同产地甘西鼠尾草和绒毛鼠尾草聚成一类,其他材料如粘毛鼠尾草、新疆鼠尾草和撒尔维亚聚成一类,表现出较丰富的遗传多样性。结合有效成分差异的研究结果,富含丹参酮和丹酚酸B的丹参聚成一类;含丹参酮和迷迭香酸的鼠尾草聚成一类;而仅含迷迭香酸的其他鼠尾草聚成一类。4.通过对不同丹参及鼠尾草根、叶和花的甲醇提取物中总酚、总黄酮含量进行测定,考察提取物的Fe离子还原能力,当样品浓度为5 mg·m L-1时,不同来源丹参表现出很高的总酚、总黄酮含量,且抗氧化能力突出。三种产地甘西鼠尾草、绒毛鼠尾草及撒尔维亚各个指标高于其他鼠尾草,表现出接近丹参药材的生物活性,而粘毛鼠尾草表现出最低的总酚、黄酮含量和较弱的抗氧化能力。相关性分析表明,不同材料不同部位总酚和总黄酮含量与其抗氧化活性表现出一致的显著正相关,说明丹参和鼠尾草所含的大量总酚和黄酮类物质具有很强的生物活性,同时说明不同鼠尾草所含化合物种类和生物学活性与丹参药材相近似。5.利用同时蒸馏萃取(simultaneous distillation extraction,SDE)法对丹参、甘西鼠尾草、撒尔维亚和新疆鼠尾草叶片和花挥发油进行提取,并利用GC-MS分析化合物种类和相对含量,结果表明:丹参和不同鼠尾草叶片和花均含挥发油,且含量随植物种类和组织的不同有所变化。丹参叶片和花挥发油主要含香橙烯氧化物(aromadendrene oxide)和石竹烯(caryophyllene);甘西鼠尾草叶片和花挥发油均含柠檬烯(limonene);撒尔维亚叶和花挥发油分别含大量β-侧柏酮和α-侧柏酮(thujone),新疆鼠尾草叶和花挥发油分别含较多喇叭茶醇(ledol)和β-水芹烯(β-phellandrene)。通过对挥发油中11个共有化合物进行主成分分析,PC1和PC2可区分富含不同化合物的丹参及鼠尾草。通过对不同材料挥发油中所有化合物种类进行聚类分析,丹参和甘西鼠尾草聚成一类,新疆鼠尾草和撒尔维亚聚成一类。说明丹参和鼠尾草挥发油化学组成具有一定相似性,同时又具有遗传多样性和组织特异性。6.通过有效成分差异与遗传多样性的分析,筛选绒毛鼠尾草作为深入研究对象。首次利用发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes ATCC 15834对培养的绒毛鼠尾草无菌苗进行侵染并诱导毛状根,诱导率在3.92%~8%之间。筛选生长快、丹参酮含量高的毛状根株系进行扩大培养,选择6,7-V液体培养基作为最适培养基。在6,7-V培养基中生长30 d的绒毛鼠尾草毛状根,丹参酮IIA含量达0.91 mg·g-1 DW,高于相同培养条件下丹参毛状根中其含量,这与绒毛鼠尾草原植物中丹参酮含量高于丹参相一致,说明绒毛鼠尾草毛状根是获取丹参酮化合物的优良材料。同时考察了毛状根生长动力学,培养30 d内呈S型生长曲线,最终选择生长18 d的处于生长旺盛期的毛状根作为研究对象。7.利用Ag+、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,Me JA)和酵母提取物(yeast extract elicitor,YE)三种诱导子对绒毛鼠尾草毛状根进行处理,考察诱导子对毛状根生长和有效成分积累的影响,同时筛选最适浓度诱导子进行时间响应处理。15μM Ag+可增加毛状根鲜重,丹参酮IIA含量是对照组1.8倍;200μM Me JA处理毛状后干重增加,隐丹参酮和丹参酮IIA含量分别是对照组1.5倍和1.99倍。200 mg·L-1 YE处理毛状根干重增加显著,是对照组1.73倍。同时发现,YE处理毛状根后,二氢丹参酮含量从未检出达到最高1.95±0.09 mg·g-1 DW,说明YE显著激活并促进了二氢丹参酮的产生。隐丹参酮含量达2.84±0.33 mg·g-1 DW,是对照组(0.34±0.04 mg·g-1 DW)的8.37倍;丹参酮IIA含量达2.52±0.67 mg·g-1 DW,是对照组(0.907 mg·g-1 DW)的2.77倍。说明酵母提取物是促进绒毛鼠尾草毛状根中丹参酮积累的最佳诱导子。时间响应试验表明,不同诱导子处理毛状根后,有效成分在不同处理时间点(0 d、0.5 d、1 d、2 d、4 d、7 d)其积累变化规律呈现多样性,多数有效成分积累的最大值出现在诱导子处理的中后期。8.通过同源克隆的方法获得绒毛鼠尾草毛状根中丹参酮次生代谢途径四个关键基因:3-羟基-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)、1-脱氧-木酮糖5-磷酸还原异构酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase,DXR)、异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase,IPPI)及牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPS)的序列片段,BLAST结果表明,其序列信息与丹参中相关基因高度相似。并考察了三种诱导子在最适浓度下对四个基因的表达调控作用。结果表明:毛状根中HMGR、DXR和GGPPS基因的相对表达量在15μM Ag+处理12 h增加显著,并于处理24 h达到最大值,分别为对照组的3倍,2倍和4.6倍;200μM Me JA处理毛状后不同基因的相对表达量在不同时间分别达到最大值。200 mg·L-1 YE处理毛状根后,IPPI的相对表达量在12 h显著增加,是对照组13.9倍。HMGR和GGPPS的相对表达水平在处理24 h增加显著,分别是对照组的5.6倍和16.7倍。DXR转录水平在YE处理4 d时是对照组中DXR相对表达量的5.9倍。说明酵母提取物对绒毛鼠尾草毛状根中丹参酮次生代谢相关基因的调控作用显著,这与其对毛状根中丹参酮化合物积累的促进作用相一致。