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目的：本研究旨在探讨TXNIP在糖尿病肾病足细胞表型转化以及凋亡中的作用及其相关分子机制，为进一步阐明糖尿病肾病的发病机制，探索糖尿病肾病防治新靶点提供理论依据。
方法：
1TXNIP基因敲除对糖尿病小鼠足细胞表型转化及凋亡相关基因表达的形态学及分子生物学检测
应用类转录激活因子效应激活物核酸酶(transcription activator‐like effector nucleases, TALEN)技术建立C57BL/6J为背景的TXNIP基因敲除(TXNIP-/-, TXNIP knockout, TKO)小鼠动物模型，野生型(wild type, WT)小鼠作为对照。取雄性WT小鼠和TKO小鼠(8周龄)各16只，随机分为4组：野生型对照组(WT)、糖尿病组(WT+DM)、TXNIP基因敲除组(TKO)与TXNIP基因敲除+糖尿病组(TKO+DM)，每组8只小鼠。糖尿病模型制备采用腹腔注射STZ(50mg/kg,pH4.5,溶于0.1M枸橼酸盐缓冲剂)，连续5天，对照组小鼠给予相同体积的枸橼酸盐缓冲剂。给药3天后测定小鼠血糖，凡全血血糖≥16.7mmol/L，尿糖+++～++++者确定为糖尿病模型。实验期间4组动物自由进食和饮水而且不使用胰岛素或其他降糖药物，每两周测一次血糖，同时监测各组小鼠的进食和饮水情况。糖尿病小鼠模型建成16周后，称重后处死各组小鼠，收集其血、尿标本，用于各项生化指标的检测；同时切取双侧肾脏，称重后去掉肾脏被膜，切取部分肾组织分别置于4%多聚甲醛和4%戊二醛中固定，用于光学显微镜、免疫组织化学、免疫组织荧光共染色及透射电子显微镜检测；部分肾组织用OCT包埋后保存于-80℃冰箱，用于冰冻切片的制作；其余肾组织切取肾皮质保存于-80℃冰箱，用于蛋白质和RNA的提取，进行Westernblot和RT-qPCR的检测。Westernblot检测TXNIP、nephrin、synaptopodin、Nox1和Nox4的蛋白表达情况，RT-qPCR检测nephrin、synaptopodin、Nox1和Nox4的mRNA表达情况，免疫荧光共染色检测CleavedCaspase-3、Bax、Raptor、Rictor、p-S6、p-AKTSER473、p-p38MAPK和synaptopodin的表达。
2敲低TXNIP对高糖诱导的小鼠足细胞EMT的影响及作用机制研究
利用DMEM-F12培养基培养小鼠条件性永生足细胞，为了使其增殖，足细胞生长于33℃环境中。当足细胞达到70-80%融合时，将细胞转移至37℃环境中使其分化，培养14-20天，然后进行后续实验。
⑴观察敲低TXNIP对于HG诱导的EMT、氧化应激以及mTOR信号通路活化的影响：
按照FuGENEHD转染试剂的说明，向足细胞转染TXNIPshRNA质粒或空白对照质粒。将足细胞随机分为正常糖对照组(5.6 mmol/L glucose, NG)、高渗对照组(5.6mmol/Lglucose+24.4mmol/Lmannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose, HG)、高糖+空白质粒组(30mmol/Lglucose+controlshRNA,HG+C)、高糖+TXNIPshRNA质粒组(30mmol/Lglucose+TXNIPshRNA,HG+shRNA)。细胞分组刺激48h后，收集细胞并进行后续实验。Westernblot检测足细胞α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin、synaptopodin、Raptor、Rictor、p-S6、p-AKTSER473、Nox1与Nox4的蛋白表达水平；RT-qPCR检测足细胞α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin、synaptopodin、Raptor、Rictor、Nox1与Nox4的mRNA表达水平；免疫荧光检测足细胞α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin与synaptopodin的表达；流式细胞术检测足细胞内ROS的产生，利用MitoSoxRed借助激光共聚焦显微镜观察线粒体ROS的产生。
⑵观察抑制mTOR通路对HG诱导的足细胞EMT与氧化应激的影响：
向足细胞转染RaptorshRNA质粒、RictorshRNA质粒和空白对照质粒，将足细胞随机分为正常糖对照组(5.6 mmol/L glucose, NG)、高渗对照组(5.6mmol/Lglucose+24.4mmol/Lmannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose, HG)、高糖+空白质粒对照组(30mmol/Lglucose+controlshRNA,HG+C)、高糖+RaptorshRNA质粒组(30mmol/Lglucose+RaptorshRNA,HG+RaptorshRNA)、高糖+RictorshRNA质粒组(30mmol/Lglucose+RictorshRNA,HG+RictorshRNA)以及高糖+KU-0063794组(30mmol/Lglucose+1μmol/LKU-0063794,HG+KU)，足细胞分组刺激48h后，收集细胞，然后进行以下实验。Westernblot检测足细胞α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin、synaptopodin、Nox1和Nox4的蛋白表达；RT-qPCR检测足细胞α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin、synaptopodin、Nox1与Nox4的mRNA表达水平；免疫荧光观察足细胞α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin与synaptopodin的表达；流式细胞术检测足细胞内ROS的生成，采用MitoSoxRed染色借助共聚焦显微镜观察线粒体ROS。
⑶观察Tempol或NAC对HG诱导的足细胞EMT的影响：
将足细胞随机分为正常糖对照组(5.6 mmol/L glucose, NG)、高渗对照组(5.6mmol/Lglucose+24.4mmol/Lmannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose, HG)、高糖+Tempol组(30mmol/Lglucose+1mmol/LTempol,HG+Tempol)、高糖+NAC组(30mmol/Lglucose+5mmol/LNAC,HG+NAC)，足细胞分组刺激48h后收集细胞，并进行后续实验。Westernblot检测足细胞内α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin以及synaptopodin的蛋白表达状况；RT-qPCR检测足细胞内α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin及synaptopodin的mRNA表达；免疫荧光检测足细胞内α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin及synaptopodin的表达情况。
3敲低TXNIP对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的影响及作用机制研究
小鼠条件性永生足细胞的培养方法同前。当足细胞分化成熟后，进行后续实验。
⑴观察敲低TXNIP对HG诱导的凋亡和p38MAPK信号通路活化的影响：
按照FuGENEHD转染试剂的说明，向足细胞转染TXNIPshRNA质粒或空白对照质粒。将足细胞随机分为正常糖对照组(5.6 mmol/L glucose, NG)、高渗对照组(5.6mmol/Lglucose+24.4mmol/Lmannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose, HG)、高糖+空白质粒组(30mmol/Lglucose+controlshRNA,HG+C)、高糖+TXNIPshRNA质粒组(30mmol/Lglucose+TXNIPshRNA,HG+shRNA)。细胞分组刺激48h后，收集细胞并进行后续实验。Westernblot检测足细胞CleavedCaspase-3、Bax、Bcl-2、p-p38MAPK和p38MAPK的蛋白表达水平；RT-qPCR检测足细胞Caspase-3、Bax与Bcl-2的mRNA表达水平；TUNEL和PEAnnexinV/7-AAD染色检测足细胞凋亡。
⑵观察抑制mTOR通路对HG诱导的足细胞凋亡的影响：
向足细胞转染RaptorshRNA质粒、RictorshRNA质粒和空白对照质粒，将足细胞随机分为正常糖对照组(5.6 mmol/L glucose, NG)、高渗对照组(5.6mmol/Lglucose+24.4mmol/Lmannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose, HG)、高糖+空白质粒对照组(30mmol/Lglucose+controlshRNA,HG+C)、高糖+RaptorshRNA质粒组(30mmol/Lglucose+RaptorshRNA,HG+RaptorshRNA)、高糖+RictorshRNA质粒组(30mmol/Lglucose+RictorshRNA,HG+RictorshRNA)以及高糖+KU-0063794组(30mmol/Lglucose+1μmol/LKU-0063794,HG+KU)，足细胞分组刺激48h后，收集细胞，然后进行以下实验。Westernblot检测足细胞CleavedCaspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表达；RT-qPCR检测足细胞Caspase-3、Bax与Bcl-2的mRNA表达水平；分别利用TUNEL与PEAnnexinV/7-AAD检测足细胞凋亡。
⑶观察抑制p38MAPK通路对HG诱导的足细胞凋亡的影响：
将足细胞随机分为正常糖对照组(5.6 mmol/L glucose, NG)、高渗对照组(5.6mmol/Lglucose+24.4mmol/Lmannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose, HG)、高糖+SB203580组(30mmol/Lglucose+10μmol/LSB203580,HG+SB)，足细胞分组刺激48h后，收集细胞，并进行后续实验。Westernblot检测足细胞CleavedCaspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白水平；RT-qPCR检测足细胞Caspase-3、Bax与Bcl-2的mRNA水平；TUNEL和PEAnnexinV/7-AAD染色检测足细胞凋亡。
结果：
1TXNIP基因敲除对糖尿病小鼠足细胞表型转化与凋亡相关基因表达的影响
①糖尿病WT小鼠的尿蛋白和尿8-OHdG表达明显升高，这一情况在糖尿病TKO小鼠得到了改善(P＜0.05)。与非糖尿病小鼠相比，糖尿病小鼠的血清中肌酐、尿素氮及甘油三酯的水平明显增高，而这些指标在糖尿病TKO小鼠中的表达显著降低(P＜0.05)。②糖尿病小鼠表现出轻微的肾小球肥大、系膜基质增生、GBM增厚和足细胞足突消失融合，而敲除TXNIP基因可以缓解上述形态学改变。③免疫组织化学结果表明，糖尿病小鼠足细胞的WT-1、nephrin和synaptopodin表达明显减少，糖尿病TKO小鼠中上述指标的表达降低被改善(P＜0.05)。Nox1与Nox4在WT+DM组小鼠肾小球中表达明显增加，而TXNIP基因敲除可以逆转Nox1与Nox4的高表达(P＜0.05)。④Westernblot结果表明，糖尿病WT小鼠中TXNIP、Nox1和Nox4的蛋白水平显著高于非糖尿病对照组小鼠，敲除TXNIP基因可以逆转TXNIP、Nox1与Nox4的高表达(P＜0.05)。nephrin与synaptopodin的表达水平在糖尿病WT小鼠中呈现下降趋势，而糖尿病TKO小鼠中nephrin和synaptopodin的表达水平有所回升(P＜0.05)。⑤与WT小鼠相比，nephrin和synaptopodin的mRNA水平下降，Nox1与Nox4的mRNA水平升高，而这一情况在糖尿病TKO小鼠得以改善(P＜0.05)。⑥免疫荧光共染色发现，与WT对照组相比，CleavedCaspase-3、Bax、Raptor、Rictor、p-S6、p-AKTSER473与p-p38MAPK的表达在WT+DM组小鼠足细胞显著增多，而敲除TXNIP基因可以逆转上述指标的高表达。
2敲低TXNIP对HG诱导的足细胞EMT的影响及其作用机制
⑴敲低TXNIP对HG诱导的EMT、氧化应激和mTOR信号通路的影响：①Westernblot结果显示，与NG组相比，HG组足细胞α-SMA、desmin、Raptor、Rictor、p-S6、p-AKTSER473、Nox1和Nox4蛋白水平明显增高，E-cadherin、nephrin和synaptopodin的蛋白水平显著降低(P＜0.05)。然而，敲低TXNIP下调了α-SMA、desmin、Raptor、Rictor、p-S6、p-AKTSER473、Nox1和Nox4蛋白的高表达，上调了E-cadherin、nephrin和synaptopodin蛋白的低表达(P＜0.05)。②对比NG组，HG组足细胞的α-SMA、desmin、Raptor、Rictor、Nox1和Nox4的mRNA表达明显增加，nephrin、E-cadherin与synaptopodin表达明显下降，而这些改变可以被TXNIP基因沉默而逆转(P＜0.05)。③免疫荧光结果表明HG组足细胞中α-SMA与desmin表达增多而E-cadherin、nephrin与synaptopodin表达减少，TXNIP基因沉默可以逆转这些变化。④HG组足细胞内和线粒体ROS水平比NG组显著升高，而敲低TXNIP可以抑制HG诱导的ROS生成(P＜0.05)。
⑵抑制mTOR通路对HG诱导的足细胞EMT和氧化应激的影响：①Westernblot结果表明，HG组足细胞α-SMA、desmin、Nox1和Nox4的蛋白表达明显增多，E-cadherin、nephrin和synaptopodin的表达降低，抑制mTOR通路可以逆转以上改变(P＜0.05)。②RT-qPCR显示，HG组足细胞α-SMA、desmin、Nox1与Nox4的mRNA水平明显高于NG组，E-cadherin、nephrin和synaptopodin的mRNA水平明显低于NG组(P＜0.01)，抑制mTOR通路可以改善以上变化(P＜0.05)。③免疫荧光显示，HG可以提高足细胞α-SMA与desmin的表达并降低E-cadherin、nephrin和synaptopodin的表达，抑制mTOR通路可以反转这一趋势。④HG条件下足细胞生成的细胞内与线粒体ROS比NG条件下更多，抑制mTOR信号通路可以减少ROS生成(P＜0.05)。
⑶Tempol或NAC对HG诱导的足细胞EMT的影响：①与NG组相比，HG组足细胞α-SMA和desmin的mRNA与蛋白水平显著升高，E-cadherin、nephrin与synaptopodin的mRNA和蛋白水平明显下降，而Tempol或NAC可以逆转上述指标的改变(P＜0.05)。②免疫荧光结果与Westernblot结果保持一致。
3敲低TXNIP对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的影响及其作用机制
⑴敲低TXNIP对于HG诱导的足细胞凋亡和p38MAPK信号通路活化的影响：①Westernblot结果表明，与NG组相比，HG组足细胞CleavedCaspase-3蛋白表达、p38MAPK的磷酸化水平和Bax/Bcl-2蛋白比值明显升高(P＜0.05)。然而，敲低TXNIP可以抑制HG诱导的CleavedCaspase-3的蛋白高表达、p38MAPK的磷酸化水平以及Bax/Bcl-2蛋白比值的升高(P＜0.05)。②对比NG组，HG组足细胞的Caspase-3和Bax的mRNA表达明显增加，Bcl-2mRNA的表达明显下降，而这些改变可以被TXNIP基因沉默而逆转(P＜0.05)。③TUNEL和PEAnnexinV/7-AAD染色显示，HG组足细胞凋亡率明显高于NG组，沉默TXNIP基因可以抑制HG诱导的足细胞凋亡(P＜0.05)。
⑵抑制mTOR通路对HG诱导的足细胞凋亡的影响：①Westernblot结果显示，与NG组相比，HG组足细胞CleavedCaspase-3蛋白表达和Bax/Bcl-2蛋白比值明显增高(P＜0.05)。然而，抑制mTOR通路可以降低HG诱导的CleavedCaspase-3蛋白高表达以及Bax/Bcl-2蛋白比值的升高(P＜0.05)。②和NG组相比，HG组足细胞的Caspase-3和Bax的mRNA表达明显增多，Bcl-2mRNA的表达明显降低，而这些改变可以被mTOR通路的抑制所逆转(P＜0.05)。③TUNEL和PEAnnexinV/7-AAD染色显示，HG组足细胞凋亡率明显高于NG组，抑制mTOR通路活化能够降低HG条件下的足细胞凋亡率(P＜0.05)。
⑶抑制p38MAPK信号通路对HG诱导的足细胞凋亡的影响：①Westernblot结果表明CleavedCaspase-3和Bax/Bcl-2蛋白比值在HG组明显增高，而SB203580可以降低CleavedCaspase-3与Bax/Bcl-2比值的高表达(P＜0.05)。②与NG组相比，HG组足细胞Caspase-3与Bax的mRNA水平明显上升而Bcl-2明显降低，SB203580可以抑制上述变化(P＜0.05)。③TUNEL与PEAnnexinV/7-AAD染色表明，HG诱导的足细胞凋亡率升高可以被SB203580所抑制(P＜0.05)。
结论：
1TXNIP基因敲除可以改善糖尿病小鼠的肾功能损害并降低肾组织氧化应激水平。敲除TXNIP基因能够抑制DN时足细胞缺失、足细胞表型转化、足细胞中凋亡相关蛋白的表达以及p38MAPK和mTOR信号通路的活化。
2敲低TXNIP可抑制HG诱导的足细胞EMT、氧化应激以及mTOR信号通路的活化；mTOR信号通路参与了HG诱导的足细胞EMT与氧化应激的过程；Tempol或NAC这两种抗氧化剂可以抑制HG诱导的足细胞EMT。因而，敲低TXNIP减少HG诱导的足细胞EMT可能是通过抑制氧化应激或mTOR激活实现的。
3敲低TXNIP可抑制HG诱导的足细胞凋亡和p38MAPK通路的活化。敲低TXNIP减少HG诱导的足细胞凋亡可能是通过抑制mTOR或p38MAPK通路活化实现的。
方法：
1TXNIP基因敲除对糖尿病小鼠足细胞表型转化及凋亡相关基因表达的形态学及分子生物学检测
应用类转录激活因子效应激活物核酸酶(transcription activator‐like effector nucleases, TALEN)技术建立C57BL/6J为背景的TXNIP基因敲除(TXNIP-/-, TXNIP knockout, TKO)小鼠动物模型，野生型(wild type, WT)小鼠作为对照。取雄性WT小鼠和TKO小鼠(8周龄)各16只，随机分为4组：野生型对照组(WT)、糖尿病组(WT+DM)、TXNIP基因敲除组(TKO)与TXNIP基因敲除+糖尿病组(TKO+DM)，每组8只小鼠。糖尿病模型制备采用腹腔注射STZ(50mg/kg,pH4.5,溶于0.1M枸橼酸盐缓冲剂)，连续5天，对照组小鼠给予相同体积的枸橼酸盐缓冲剂。给药3天后测定小鼠血糖，凡全血血糖≥16.7mmol/L，尿糖+++～++++者确定为糖尿病模型。实验期间4组动物自由进食和饮水而且不使用胰岛素或其他降糖药物，每两周测一次血糖，同时监测各组小鼠的进食和饮水情况。糖尿病小鼠模型建成16周后，称重后处死各组小鼠，收集其血、尿标本，用于各项生化指标的检测；同时切取双侧肾脏，称重后去掉肾脏被膜，切取部分肾组织分别置于4%多聚甲醛和4%戊二醛中固定，用于光学显微镜、免疫组织化学、免疫组织荧光共染色及透射电子显微镜检测；部分肾组织用OCT包埋后保存于-80℃冰箱，用于冰冻切片的制作；其余肾组织切取肾皮质保存于-80℃冰箱，用于蛋白质和RNA的提取，进行Westernblot和RT-qPCR的检测。Westernblot检测TXNIP、nephrin、synaptopodin、Nox1和Nox4的蛋白表达情况，RT-qPCR检测nephrin、synaptopodin、Nox1和Nox4的mRNA表达情况，免疫荧光共染色检测CleavedCaspase-3、Bax、Raptor、Rictor、p-S6、p-AKTSER473、p-p38MAPK和synaptopodin的表达。
2敲低TXNIP对高糖诱导的小鼠足细胞EMT的影响及作用机制研究
利用DMEM-F12培养基培养小鼠条件性永生足细胞，为了使其增殖，足细胞生长于33℃环境中。当足细胞达到70-80%融合时，将细胞转移至37℃环境中使其分化，培养14-20天，然后进行后续实验。
⑴观察敲低TXNIP对于HG诱导的EMT、氧化应激以及mTOR信号通路活化的影响：
按照FuGENEHD转染试剂的说明，向足细胞转染TXNIPshRNA质粒或空白对照质粒。将足细胞随机分为正常糖对照组(5.6 mmol/L glucose, NG)、高渗对照组(5.6mmol/Lglucose+24.4mmol/Lmannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose, HG)、高糖+空白质粒组(30mmol/Lglucose+controlshRNA,HG+C)、高糖+TXNIPshRNA质粒组(30mmol/Lglucose+TXNIPshRNA,HG+shRNA)。细胞分组刺激48h后，收集细胞并进行后续实验。Westernblot检测足细胞α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin、synaptopodin、Raptor、Rictor、p-S6、p-AKTSER473、Nox1与Nox4的蛋白表达水平；RT-qPCR检测足细胞α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin、synaptopodin、Raptor、Rictor、Nox1与Nox4的mRNA表达水平；免疫荧光检测足细胞α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin与synaptopodin的表达；流式细胞术检测足细胞内ROS的产生，利用MitoSoxRed借助激光共聚焦显微镜观察线粒体ROS的产生。
⑵观察抑制mTOR通路对HG诱导的足细胞EMT与氧化应激的影响：
向足细胞转染RaptorshRNA质粒、RictorshRNA质粒和空白对照质粒，将足细胞随机分为正常糖对照组(5.6 mmol/L glucose, NG)、高渗对照组(5.6mmol/Lglucose+24.4mmol/Lmannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose, HG)、高糖+空白质粒对照组(30mmol/Lglucose+controlshRNA,HG+C)、高糖+RaptorshRNA质粒组(30mmol/Lglucose+RaptorshRNA,HG+RaptorshRNA)、高糖+RictorshRNA质粒组(30mmol/Lglucose+RictorshRNA,HG+RictorshRNA)以及高糖+KU-0063794组(30mmol/Lglucose+1μmol/LKU-0063794,HG+KU)，足细胞分组刺激48h后，收集细胞，然后进行以下实验。Westernblot检测足细胞α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin、synaptopodin、Nox1和Nox4的蛋白表达；RT-qPCR检测足细胞α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin、synaptopodin、Nox1与Nox4的mRNA表达水平；免疫荧光观察足细胞α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin与synaptopodin的表达；流式细胞术检测足细胞内ROS的生成，采用MitoSoxRed染色借助共聚焦显微镜观察线粒体ROS。
⑶观察Tempol或NAC对HG诱导的足细胞EMT的影响：
将足细胞随机分为正常糖对照组(5.6 mmol/L glucose, NG)、高渗对照组(5.6mmol/Lglucose+24.4mmol/Lmannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose, HG)、高糖+Tempol组(30mmol/Lglucose+1mmol/LTempol,HG+Tempol)、高糖+NAC组(30mmol/Lglucose+5mmol/LNAC,HG+NAC)，足细胞分组刺激48h后收集细胞，并进行后续实验。Westernblot检测足细胞内α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin以及synaptopodin的蛋白表达状况；RT-qPCR检测足细胞内α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin及synaptopodin的mRNA表达；免疫荧光检测足细胞内α-SMA、E-cadherin、desmin、nephrin及synaptopodin的表达情况。
3敲低TXNIP对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的影响及作用机制研究
小鼠条件性永生足细胞的培养方法同前。当足细胞分化成熟后，进行后续实验。
⑴观察敲低TXNIP对HG诱导的凋亡和p38MAPK信号通路活化的影响：
按照FuGENEHD转染试剂的说明，向足细胞转染TXNIPshRNA质粒或空白对照质粒。将足细胞随机分为正常糖对照组(5.6 mmol/L glucose, NG)、高渗对照组(5.6mmol/Lglucose+24.4mmol/Lmannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose, HG)、高糖+空白质粒组(30mmol/Lglucose+controlshRNA,HG+C)、高糖+TXNIPshRNA质粒组(30mmol/Lglucose+TXNIPshRNA,HG+shRNA)。细胞分组刺激48h后，收集细胞并进行后续实验。Westernblot检测足细胞CleavedCaspase-3、Bax、Bcl-2、p-p38MAPK和p38MAPK的蛋白表达水平；RT-qPCR检测足细胞Caspase-3、Bax与Bcl-2的mRNA表达水平；TUNEL和PEAnnexinV/7-AAD染色检测足细胞凋亡。
⑵观察抑制mTOR通路对HG诱导的足细胞凋亡的影响：
向足细胞转染RaptorshRNA质粒、RictorshRNA质粒和空白对照质粒，将足细胞随机分为正常糖对照组(5.6 mmol/L glucose, NG)、高渗对照组(5.6mmol/Lglucose+24.4mmol/Lmannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose, HG)、高糖+空白质粒对照组(30mmol/Lglucose+controlshRNA,HG+C)、高糖+RaptorshRNA质粒组(30mmol/Lglucose+RaptorshRNA,HG+RaptorshRNA)、高糖+RictorshRNA质粒组(30mmol/Lglucose+RictorshRNA,HG+RictorshRNA)以及高糖+KU-0063794组(30mmol/Lglucose+1μmol/LKU-0063794,HG+KU)，足细胞分组刺激48h后，收集细胞，然后进行以下实验。Westernblot检测足细胞CleavedCaspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白表达；RT-qPCR检测足细胞Caspase-3、Bax与Bcl-2的mRNA表达水平；分别利用TUNEL与PEAnnexinV/7-AAD检测足细胞凋亡。
⑶观察抑制p38MAPK通路对HG诱导的足细胞凋亡的影响：
将足细胞随机分为正常糖对照组(5.6 mmol/L glucose, NG)、高渗对照组(5.6mmol/Lglucose+24.4mmol/Lmannitol,M)、高糖组(30 mmol/L glucose, HG)、高糖+SB203580组(30mmol/Lglucose+10μmol/LSB203580,HG+SB)，足细胞分组刺激48h后，收集细胞，并进行后续实验。Westernblot检测足细胞CleavedCaspase-3、Bax和Bcl-2的蛋白水平；RT-qPCR检测足细胞Caspase-3、Bax与Bcl-2的mRNA水平；TUNEL和PEAnnexinV/7-AAD染色检测足细胞凋亡。
结果：
1TXNIP基因敲除对糖尿病小鼠足细胞表型转化与凋亡相关基因表达的影响
①糖尿病WT小鼠的尿蛋白和尿8-OHdG表达明显升高，这一情况在糖尿病TKO小鼠得到了改善(P＜0.05)。与非糖尿病小鼠相比，糖尿病小鼠的血清中肌酐、尿素氮及甘油三酯的水平明显增高，而这些指标在糖尿病TKO小鼠中的表达显著降低(P＜0.05)。②糖尿病小鼠表现出轻微的肾小球肥大、系膜基质增生、GBM增厚和足细胞足突消失融合，而敲除TXNIP基因可以缓解上述形态学改变。③免疫组织化学结果表明，糖尿病小鼠足细胞的WT-1、nephrin和synaptopodin表达明显减少，糖尿病TKO小鼠中上述指标的表达降低被改善(P＜0.05)。Nox1与Nox4在WT+DM组小鼠肾小球中表达明显增加，而TXNIP基因敲除可以逆转Nox1与Nox4的高表达(P＜0.05)。④Westernblot结果表明，糖尿病WT小鼠中TXNIP、Nox1和Nox4的蛋白水平显著高于非糖尿病对照组小鼠，敲除TXNIP基因可以逆转TXNIP、Nox1与Nox4的高表达(P＜0.05)。nephrin与synaptopodin的表达水平在糖尿病WT小鼠中呈现下降趋势，而糖尿病TKO小鼠中nephrin和synaptopodin的表达水平有所回升(P＜0.05)。⑤与WT小鼠相比，nephrin和synaptopodin的mRNA水平下降，Nox1与Nox4的mRNA水平升高，而这一情况在糖尿病TKO小鼠得以改善(P＜0.05)。⑥免疫荧光共染色发现，与WT对照组相比，CleavedCaspase-3、Bax、Raptor、Rictor、p-S6、p-AKTSER473与p-p38MAPK的表达在WT+DM组小鼠足细胞显著增多，而敲除TXNIP基因可以逆转上述指标的高表达。
2敲低TXNIP对HG诱导的足细胞EMT的影响及其作用机制
⑴敲低TXNIP对HG诱导的EMT、氧化应激和mTOR信号通路的影响：①Westernblot结果显示，与NG组相比，HG组足细胞α-SMA、desmin、Raptor、Rictor、p-S6、p-AKTSER473、Nox1和Nox4蛋白水平明显增高，E-cadherin、nephrin和synaptopodin的蛋白水平显著降低(P＜0.05)。然而，敲低TXNIP下调了α-SMA、desmin、Raptor、Rictor、p-S6、p-AKTSER473、Nox1和Nox4蛋白的高表达，上调了E-cadherin、nephrin和synaptopodin蛋白的低表达(P＜0.05)。②对比NG组，HG组足细胞的α-SMA、desmin、Raptor、Rictor、Nox1和Nox4的mRNA表达明显增加，nephrin、E-cadherin与synaptopodin表达明显下降，而这些改变可以被TXNIP基因沉默而逆转(P＜0.05)。③免疫荧光结果表明HG组足细胞中α-SMA与desmin表达增多而E-cadherin、nephrin与synaptopodin表达减少，TXNIP基因沉默可以逆转这些变化。④HG组足细胞内和线粒体ROS水平比NG组显著升高，而敲低TXNIP可以抑制HG诱导的ROS生成(P＜0.05)。
⑵抑制mTOR通路对HG诱导的足细胞EMT和氧化应激的影响：①Westernblot结果表明，HG组足细胞α-SMA、desmin、Nox1和Nox4的蛋白表达明显增多，E-cadherin、nephrin和synaptopodin的表达降低，抑制mTOR通路可以逆转以上改变(P＜0.05)。②RT-qPCR显示，HG组足细胞α-SMA、desmin、Nox1与Nox4的mRNA水平明显高于NG组，E-cadherin、nephrin和synaptopodin的mRNA水平明显低于NG组(P＜0.01)，抑制mTOR通路可以改善以上变化(P＜0.05)。③免疫荧光显示，HG可以提高足细胞α-SMA与desmin的表达并降低E-cadherin、nephrin和synaptopodin的表达，抑制mTOR通路可以反转这一趋势。④HG条件下足细胞生成的细胞内与线粒体ROS比NG条件下更多，抑制mTOR信号通路可以减少ROS生成(P＜0.05)。
⑶Tempol或NAC对HG诱导的足细胞EMT的影响：①与NG组相比，HG组足细胞α-SMA和desmin的mRNA与蛋白水平显著升高，E-cadherin、nephrin与synaptopodin的mRNA和蛋白水平明显下降，而Tempol或NAC可以逆转上述指标的改变(P＜0.05)。②免疫荧光结果与Westernblot结果保持一致。
3敲低TXNIP对高糖诱导的小鼠足细胞凋亡的影响及其作用机制
⑴敲低TXNIP对于HG诱导的足细胞凋亡和p38MAPK信号通路活化的影响：①Westernblot结果表明，与NG组相比，HG组足细胞CleavedCaspase-3蛋白表达、p38MAPK的磷酸化水平和Bax/Bcl-2蛋白比值明显升高(P＜0.05)。然而，敲低TXNIP可以抑制HG诱导的CleavedCaspase-3的蛋白高表达、p38MAPK的磷酸化水平以及Bax/Bcl-2蛋白比值的升高(P＜0.05)。②对比NG组，HG组足细胞的Caspase-3和Bax的mRNA表达明显增加，Bcl-2mRNA的表达明显下降，而这些改变可以被TXNIP基因沉默而逆转(P＜0.05)。③TUNEL和PEAnnexinV/7-AAD染色显示，HG组足细胞凋亡率明显高于NG组，沉默TXNIP基因可以抑制HG诱导的足细胞凋亡(P＜0.05)。
⑵抑制mTOR通路对HG诱导的足细胞凋亡的影响：①Westernblot结果显示，与NG组相比，HG组足细胞CleavedCaspase-3蛋白表达和Bax/Bcl-2蛋白比值明显增高(P＜0.05)。然而，抑制mTOR通路可以降低HG诱导的CleavedCaspase-3蛋白高表达以及Bax/Bcl-2蛋白比值的升高(P＜0.05)。②和NG组相比，HG组足细胞的Caspase-3和Bax的mRNA表达明显增多，Bcl-2mRNA的表达明显降低，而这些改变可以被mTOR通路的抑制所逆转(P＜0.05)。③TUNEL和PEAnnexinV/7-AAD染色显示，HG组足细胞凋亡率明显高于NG组，抑制mTOR通路活化能够降低HG条件下的足细胞凋亡率(P＜0.05)。
⑶抑制p38MAPK信号通路对HG诱导的足细胞凋亡的影响：①Westernblot结果表明CleavedCaspase-3和Bax/Bcl-2蛋白比值在HG组明显增高，而SB203580可以降低CleavedCaspase-3与Bax/Bcl-2比值的高表达(P＜0.05)。②与NG组相比，HG组足细胞Caspase-3与Bax的mRNA水平明显上升而Bcl-2明显降低，SB203580可以抑制上述变化(P＜0.05)。③TUNEL与PEAnnexinV/7-AAD染色表明，HG诱导的足细胞凋亡率升高可以被SB203580所抑制(P＜0.05)。
结论：
1TXNIP基因敲除可以改善糖尿病小鼠的肾功能损害并降低肾组织氧化应激水平。敲除TXNIP基因能够抑制DN时足细胞缺失、足细胞表型转化、足细胞中凋亡相关蛋白的表达以及p38MAPK和mTOR信号通路的活化。
2敲低TXNIP可抑制HG诱导的足细胞EMT、氧化应激以及mTOR信号通路的活化；mTOR信号通路参与了HG诱导的足细胞EMT与氧化应激的过程；Tempol或NAC这两种抗氧化剂可以抑制HG诱导的足细胞EMT。因而，敲低TXNIP减少HG诱导的足细胞EMT可能是通过抑制氧化应激或mTOR激活实现的。
3敲低TXNIP可抑制HG诱导的足细胞凋亡和p38MAPK通路的活化。敲低TXNIP减少HG诱导的足细胞凋亡可能是通过抑制mTOR或p38MAPK通路活化实现的。