CJ5菌降解MCLR的酶学途径研究

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微生物降解是水体中微囊藻毒素(MC)去除的主要途径之一。目前国内外学者对MC的微生物降解过程进行了大量研究,研究内容主要集中在MC降解菌的筛选、降解机理及降解效能的提高等方面。对MC酶学降解途径的研究相对较少,且主要集中在好氧降解菌方面,目前还没有关于厌氧菌降解MC的途径研究。本实验室从滇池沉积物中分离出一株MC厌氧降解菌CJ5(Acidaminobacter sp.),该菌在厌氧条件下能够快速降解微囊藻毒素-LR(MCLR),但其降解途径尚不清楚。前期研究结果显示,厌氧MC降解菌CJ5可能与好氧MC降解菌降解MC的途径并不相同,因此有必要对MC厌氧降解菌降解MCLR的途径进行研究,从而更深入的了解MC的降解机理,为利用微生物及其产生的蛋白酶处理MC污染提供参考。本文从酶学角度出发,研究了MC厌氧降解菌CJ5降解MCLR的途径,并对影响降解酶活性的环境因素进行了研究,同时,还对降解酶进行了初步的分离纯化。具体研究内容及结果如下:(1)通过提取并验证CJ5菌不同位置的酶对MCLR的降解能力,对CJ5菌的降解酶进行了定位。结果表明,CJ5胞内酶在好氧及厌氧条件下,14h内分别可降解约90%和60%的MCLR(初始浓度为3.6mg/L);而胞外酶在90h内基本对MCLR无降解。此结果说明,CJ5菌中MC降解酶存在于细胞内,且氧气不会抑制降解酶的活性。(2)CJ5胞内酶降解MCLR产生并最终积累一种含有Adda基团的产物,质谱鉴定结果表明此产物为线性MCLR(H-Leu-MeAsp-Arg-Adda-Glu-Mdha-Ala-OH)。由此推测CJ5菌降解MCLR存在一条新的降解途径:在胞内酶的作用下,环状MCLR中Ala-Leu键断裂生成线性MCLR(H-Leu-MeAsp-Arg-Adda-Glu-Mdha-Ala-OH);随后线性MCLR中Arg-Adda和Adda-Glu键断裂生成Adda。(3)为进一步了解CJ5胞内酶的特性,研究了温度、pH、蛋白浓度、金属离子等因素对CJ5胞内酶活的影响。结果表明,CJ5胞内酶对MCLR的降解受温度和pH影响较大,最适降解温度为30℃;最适pH值约为8。CJ5胞内酶催化降解MCLR的速率受初始蛋白浓度影响较大,随着蛋白初始浓度的增加,降解速率也逐步增加。Zn2+、Ca2+、Mg2+、Al3+对CJ5胞内酶降解MCLR的过程无明显影响。(4)利用硫酸铵分级沉淀、透析脱盐、离子交换层析方法,对CJ5胞内酶进行了纯化。实验结果发现,CJ5胞内酶经60%饱和度硫酸铵盐析,透析脱盐后,3h内对MCLR的降解率约为56.1%;后经DEAE-52阴离子交换柱层析后,1mol/LNaCl洗脱组分仍具有较强MCLR降解活性,3h内对MCLR的降解率约为50%。SDS-PAGE分析结果表明,该洗脱组分含有两种蛋白,分子量约为22和80KDa。
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