猪丁型冠状病毒检测方法的建立及初步应用

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猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCo V)是冠状病毒科(Coronavirinae)δ-冠状病毒属的成员,是近年来发现的呈世界性流行的猪肠道病毒病。其临床症状表现为急性腹泻、呕吐、脱水。该病毒首先于2012年在香港被报道,2014年后,该病相继在美国韩国等国家被报道,之后便以暴发的方式在世界范围内发生与流行,对养猪业的健康发展造成了一定的影响。PDCo V的M基因和N基因比较保守,另外有研究表明,PDCo V与PEDV,TGEV的M蛋白抗原间没有交叉性反应性。因此,可以利用PDCo V的M基因和N基因构建检测方法,将为PDCo V防控提供一定的技术支持。本实验室进行了一系列研究:(1)根据Gen Bank中已发表的猪丁型冠状病毒M全基因序列进行引物设计并合成,M基因经PCR扩增,克隆测序鉴定后的质粒命名为PDCo V-M。根据p ET32a载体和M蛋白的特点进行表达引物设计,将p ET32a载体与从克隆质粒PDCo V-M中扩增的M基因连接转化构建重组表达质粒p ET32a-M并进行诱导,SDS-PAGE检测有与预期相合的50 ku左右的蛋白大量表达且蛋白主要存在于包涵体中,利用His标签对p ET32a-M蛋白进行纯化,Western-blotting显示p ET32a-M蛋白的反应原性较好。(2)利用纯化的M重组蛋白作为抗原进行了PDCo V M蛋白Ig G抗体的间接ELISA检测方法的构建,对反应条件优化和选择的结果显示M重组蛋白的适宜反应浓度为4μg/m L,37℃恒温反应2小时,4℃放置8~12 h(或过夜)包被结果更好;采用PBST工作液溶解的脱脂奶粉(5%)进行封闭效果最好,37℃恒温反应1小时;血清和酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5000,两者均37℃恒温反应1小时;TMB暗处反应20 min最佳。且此方法重复性试验(批内和批间)显示变异系数均不超过10%,与CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV阳性血清间不存在抗原交叉反应,具有较高的重复性与特异性,为PDCo V的大量检测提供了一种适于操作的ELISA诊断方法。(3)利用纯化的M重组蛋白为抗原进行了PDCo V M蛋白Ig A抗体的间接ELISA检测方法的构建,对反应条件优化和选择的结果显示M重组蛋白的适宜反应浓度为1.6μg/m L,4℃放置8~12 h(或过夜)包被结果更好;采用PBST工作液溶解的脱脂奶粉(5%)进行封闭杂蛋白的效果最好,37℃恒温反应1小时;初乳和酶标抗体的最适稀释度分别为1∶80和1∶50000,两者均37℃恒温反应1小时;TMB暗处反应15 min最佳。且此方法重复性试验(批内和批间)显示变异系数不超过10%,与CSFV、PRRSV、PEDV、TGEV阳性初乳间不存在抗原交叉反应,具有较高的重复性与特异性,为PDCo V的早期检测提供了一种简便的ELISA诊断方法。(4)以10倍梯度稀释的纯化重组PDCo V-M质粒作为标准品模板,建立了一种检测PDCo V的SYBR Green I荧光定量PCR方法。结果显示,本试验建立的检测方法在101拷贝·μL-1至107拷贝·μL-1之间线性关系均较好,相关系数R^2为1.00,扩增效率E在99%以上,检测灵敏度为53拷贝·μL-1,且与PEDV、TGEV、PRV、PCV2病毒的DNA均无交叉性反应,特异性较高;组内变异系数小于1.52%,组间变异系数小于3.15%,重复性较好,为PDCo V的诊断及分子流行病学调查提供了一种快速、定量检测方法。(5)通过Gen Bank登录的PDCo V N基因的序列设计了一组LAMP引物,所用的反应模板为p MD19T-N重组质粒,以羟基萘酚蓝为显色剂,通过对反应温度,反应物浓度等进行优化,构建了一种可直接观察结果的检测PDCo V的LAMP检测方法,并对其进行了特异性试验和灵敏度检测。结果表明,该方法特异性较好,与PEDV、TGEV、PRV、PCV2的DNA间均不存在交叉性反应;该方法灵敏度较好,可检测到的最低模板量为51拷贝·μL-1,为PDCo V的临床检测提供了一种新的方法。
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