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背景与目的前列腺癌（prostate cancer,PCa）是全世界男性中常见的侵袭性恶性肿瘤,也是男性癌症死亡的最常见原因之一。近年来,我国前列腺癌的发病率和死亡率呈明显上升趋势,其中大多数前列腺癌患者的死因是侵袭转移。因此寻找前列腺癌侵袭转移的标志物并研究其机制,为肿瘤治疗提供新靶点,成为研究者们关注的热点。外泌体是包含有多种反映其亲本细胞特征的生物活性物质的直径为30～150nm的微囊泡。随着研究的深入,发现外泌体中含有大量的微小RNA（micro RNA,mi RNA）和蛋白质是肿瘤发生发展和侵袭迁移过程中关键的参与者,还有研究证实外泌体可以一种旁分泌的方式影响肿瘤细胞的侵袭迁移过程。目前,对于外泌体中的蛋白质的研究远少于对mi RNA的研究,因此,从外泌体携带的蛋白质方面阐明肿瘤的发生发展和侵袭转移机制有望成为一个新的攻克肿瘤侵袭和转移的突破点。为此,我们对转移能力不同的PCa细胞系分泌的外泌体进行蛋白质组学测序,筛选出在转移能力较高的PCa细胞分泌的外泌体中表达量显著升高的蛋白质--层粘连蛋白β1（lamininβ1,LAMB1）,且目前尚无研究报道外泌体来源的LAMB1与PCa进展之间的关系。本研究将从以下几个方面探究外泌体来源的LAMB1对于前列腺癌发生侵袭和转移的影响:（1）探究转移能力高的PCa细胞系（PC3和DU145）分泌的外泌体对转移能力低的22RV1细胞生物学行为的影响;（2）明确LAMB1在PCa组织、细胞和细胞分泌的外泌体中的表达;（3）阐明LAMB1和外泌体来源的LAMB1是否通过调控PI3K/AKT信号通路影响PCa细胞的侵袭和迁移;（4）体内验证外泌体来源的LAMB1对PCa的侵袭和迁移的影响。方法1转移能力高的PCa细胞系分泌的外泌体对转移能力低的22RV1细胞生物学行为的影响1.1采用超速离心法提取PCa细胞分泌的外泌体,用蛋白质印迹法（Western blot）、纳米粒子追踪技术（Nanosight Tracking Analysis,NTA）和透射电镜（transmission electron microscope,TEM）鉴定外泌体。1.2用转移能力高的PCa细胞系（PC3和DU145）分泌的外泌体与转移能力低的22RV1细胞共孵育,采用克隆形成、Transwell和流式细胞术来检测22RV1细胞的生物学行为以及用Western blot实验来检测上皮间质转换（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白、MMP2、MMP9、Bcl2和Bax蛋白的表达。2 LAMB1在PCa组织、细胞和细胞分泌的外泌体中的表达通过蛋白质组学测序、Western blot、免疫组织化学法（Immunohistochemistry,IHC）和数据库分析检测LAMB1在PCa组织、细胞和细胞分泌的外泌体中的表达。3 LAMB1和外泌体来源的LAMB1通过调控PI3K/AKT信号通路影响PCa细胞的侵袭和迁移3.1蛋白质组学测序和KEGG通路注释分析结果显示外泌体来源的LAMB1可能通过PI3K/AKT信号通路改变PCa细胞的生物学行为。PC3和DU145细胞分泌的外泌体与22RV1细胞共孵育后,用Western blot来检测22RV1细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。3.2采用克隆形成、Transwell和流式细胞术来检测LAMB1的表达下调对PCa细胞生物学行为的影响以及用Western blot检测EMT相关蛋白、MMP2、MMP9、Bcl2、Bax和PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达。3.3提取稳定下调LAMB1的PC3/sh RNA-LAMB1和PC3/sh RNA-NC细胞分泌的外泌体与22RV1细胞进行共孵育后,采用克隆形成、Transwell和流式细胞术来检测22RV1细胞生物学行为的改变以及用Western blot检测EMT相关蛋白、MMP2、MMP9、Bcl2、Bax和PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的变化。4体内验证外泌体来源的LAMB1对PCa的侵袭和迁移的影响用转移能力低的22RV1细胞构建BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型,每隔三天瘤内注射PBS、PC3/sh RNA-LAMB1细胞或PC3/sh RNA-NC细胞分泌的外泌体（10μg）,并测量肿瘤的大小和体重。注射8次后,观察外泌体来源的LAMB1对裸鼠PCa移植瘤侵袭和迁移的影响。结果1转移能力高的PCa细胞系分泌的外泌体对转移能力低的22RV1细胞生物学行为的影响1.1 Western blot、NTA和TEM结果表明提取的微囊泡是外泌体。1.2 PC3和DU145细胞分泌的外泌体可以促进22RV1细胞的克隆形成、侵袭、迁移和抗凋亡能力（P＜0.05）。同时升高22RV1细胞中N-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9和Bcl2蛋白的表达（P＜0.05）;降低E-cadherin和Bax蛋白的表达（P＜0.05）。2 LAMB1在PCa组织、细胞和细胞分泌的外泌体中的表达LAMB1在发生转移和恶性程度高的PCa组织中高表达;同时LAMB1在转移能力强的PCa细胞系（PC3和DU145）及其分泌的外泌体中的表达显著升高（P＜0.05）。3 LAMB1和外泌体来源的LAMB1通过调控PI3K/AKT信号通路影响PCa细胞的侵袭和迁移3.1 Western blot结果表明PC3和DU145细胞分泌的外泌体可以促进22RV1细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达（P＜0.05）。3.2 LAMB1表达下调可以抑制PCa细胞的克隆形成、侵袭、迁移和抗凋亡能力（P＜0.05）。LAMB1表达下调可以降低PCa细胞中N-cadherin、Vimentin、MMP2、MMP9和Bcl2蛋白的表达（P＜0.05）,升高PCa细胞中E-cadherin和Bax蛋白的表达（P＜0.05）;同时LAMB1表达下调可以降低PCa细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达（P＜0.05）。3.3外泌体中LAMB1的表达下调减弱对22RV1细胞的克隆形成、侵袭、迁移和抗凋亡能力的促进作用（P＜0.05）;减弱对EMT相关蛋白、MMP2、MMP9、Bcl2和Bax蛋白的影响（P＜0.05）;同时减弱对PI3K/AKT信号通路相关蛋白的影响（P＜0.05）。4体内验证外泌体来源的LAMB1对PCa的侵袭和迁移的影响我们已经构建了22RV1细胞BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型,将在六月中旬得到实验结果。结论1 LAMB1在PCa发生转移和恶性程度高的组织和细胞系中均高表达,且在转移能力高的PCa细胞系分泌的外泌体中高表达。2转移能力高的PCa细胞把LAMB1通过外泌体传递到转移能力低的22RV1细胞中,并通过激活PI3K/AKT信号通路促进其侵袭迁移和抗凋亡能力。