中药复方是中医临床用药的精髓,具有多成分、多途径、多靶点的作用特点。从化学本质上来讲,中药复方是不同中药的多组分构成的一个系统的、复杂的相互作用体系,最终发挥减毒增效的作用。由于中药复方的复杂性,迄今仍难以完整地提供复方疗效的现代科学依据,阐释中药复方药物间相互作用及其机制。药物相互作用从机理上主要分为理化相互作用、药动学相互作用和药效学相互作用。其中,药动学相互作用可导致中药复方药动学/药效强度或毒性发生改变,是药物体内相互作用的主要原因。目前复方药动学相互作用多集中于体内血药浓度的测定,以及吸收环节和体内外代谢物的分析等,而反映代谢、分布和排泄等环节的相互作用及其机理研究,由于受到实验手段的限制目前开展的研究十分有限。中药复方的药动学相互作用,即指药物在吸收、分布、代谢和排泄环节上的相互影响,其中以代谢性相互作用最为普遍,它是中药复方药代动力学的重点也是难点。肝脏是药物代谢的重要器官,是机体进行生物转化的主要场所,富含着参与药物代谢的酶系统。目前,人们对中药复方体外肝代谢的研究常用肝微粒体温孵法,但该方法存在以下问题:一是,将药物直接与肝微粒体温孵进行体外肝代谢观察只适合单体成分或几种代表成分的研究,不适合中药复方多组分的研究;二是,中药提取液组成复杂,组分在肠道经历吸收代谢及其相互影响,将中药提取液直接与肝微粒体温孵,不符合中药体内肝代谢的实际过程;三是,Ⅰ相和Ⅱ相代谢通路是相互竞争的,但实验时通常对它们进行单独监测,这样操作会导致一定的偏差,不能代表体内的实际的生物转化情况,因为它们是相互竞争的通路。因此,要真正探讨中药复方多组分的体内代谢过程,应针对其多组分在体内实际运行过程及其之间的相互作用进行客观分析。这就亟需创建新型的适合中药复杂体系的体外多组分肝代谢实验模型。基于上述问题,本课题建立了一种新型的反应中药复方多组分及其相互作用的体外肠吸收-肝代谢联动模型,即结合体内诱导将常用的体外吸收模型肠囊法与体外肝代谢模型肝微粒体温孵法相结合的研究模式。在本模型中,肠囊法得到的肠渗透液相当于药物经胃肠道吸收代谢之后,进入肝门静脉之前的成分,将这些成分与肝微粒体同时启动Ⅰ相和Ⅱ相代谢通路进行孵育,这能够真实的模拟药物在体内的吸收代谢特点和相互作用的过程。同时,本课题首次采用差异表达蛋白质组学的分析方法,考察黄芩、黄连及其药对对大鼠肝组织功能蛋白的调控作用,以此来探讨黄芩-黄连的作用靶点,为中药体内相互作用提供新的评价方法。为此,本课题开展了以下几方面探索研究:一、中药黄芩和黄连药材主要成分定性定量分析方法的建立按照《中国药典》2015版,制备黄芩和黄连供试品溶液;采用HPLC-LTQ-Orbitrap-MS全扫描方式分别对黄芩和黄连中的主要成分进行定性分析,在黄芩中共鉴定出29种黄酮类成分,其中黄酮苷类16种,黄酮苷元类13种,在黄连中共鉴定出12种生物碱类成分;同时,采用建立的HPLC法分别对黄芩和黄连饮片中的各6种主要成分进行含量测定,均符合药典标准,可用于后续实验中。二、黄芩黄连多组分体外肠吸收特性及其配伍的相互作用采用已建立的HPLC-MS/MS鉴定了黄芩和黄连水煎液大鼠体外肠渗透成分,结果发现黄芩黄酮类成分在整个肠道皆有吸收,有较长的吸收窗;除黄芩素外黄芩中的28种成分均出现在肠渗透液中,且未发现有新成分产生;黄连生物碱类成分在整个肠道皆有吸收,有较长的吸收窗。分别建立了黄芩和黄连主要成分大鼠体外肠吸收HPLC分析方法,通过对其主要成分的肠吸收动力学参数计算,并结合SPSS软件分析,对22种黄酮类成分和10种生物碱成分的吸收特性进行研究。结果发现,黄芩黄酮类成分和黄连生物碱类成分在肠道中均存在广泛的吸收,但对吸收部位具有选择性;小肠是其主要的吸收部位,结肠的吸收较差;黄酮苷元比黄酮苷容易吸收,这可能与黄酮苷和黄酮苷元的性质有关,或者与黄酮苷元容易发生代谢有关;生物碱类成分的吸收较差,这可能与P-gp的外排作用有关;由于多组分之间存在着相互作用,使得各成分的吸收优于单体的吸收。采用灌胃诱导后的大鼠肠囊法模型,探讨了黄芩黄连配伍对黄芩黄酮类成分和黄连生物碱类成分大鼠体内肠吸收的影响。结果发现,经诱导后,黄芩各黄酮类成分和黄连各生物碱类成分的吸收特征均发生了变化;黄连可抑制黄芩黄酮类成分的吸收,药对可促进其吸收,这说明配伍黄连后,有利于黄芩药效的发挥,两者合用,相得益彰;黄芩和药对均可促进黄连生物碱的吸收,药对的作用更强,从而进一步验证了黄芩黄连作为相须药对,配伍后其作用更强的特点。三、体外法评价黄芩黄连多组分体内肝代谢特性及配伍的相互作用采用体外肝微粒体温孵法,将由大鼠肠囊法得到的黄芩黄连肠渗透液与大鼠肝微粒体进行体外温孵。分别建立了黄芩和黄连肠渗透液成分大鼠体外肝脏Ⅰ相、Ⅱ相代谢反应体系中HPLC分析方法,探索黄芩和黄连化学成分在大鼠体内肝脏Ⅰ相、Ⅱ相代谢动力学特性。结果显示,黄芩黄酮类成分在Ⅰ相代谢中,主要发生了水解反应,黄酮苷类成分的浓度随着时间的延长降低,而黄酮苷元类成分的浓度升高;在Ⅱ相代谢中,主要发生了葡萄糖醛酸结合反应,黄酮苷类成分的浓度随着时间的延长升高,而黄酮苷元类成分的浓度降低。黄连生物碱类成分在Ⅰ相代谢中,主要发生了水解反应,各种成分呈现不同的代谢状态;在Ⅱ相代谢,各成分都发生了葡萄糖醛酸结合反应,其浓度随着时间的延长而降低。采用经灌胃诱导的大鼠肝微粒体温孵模型,分别考察黄芩黄连配伍对黄芩和黄连肠渗透成分在肝脏Ⅰ相、Ⅱ相反应体系中的代谢动力学的影响。结果发现黄连和药对均可抑制黄芩黄酮的代谢,黄连的作用更强;黄芩和药对均可抑制黄连生物碱的代谢,药对的作用更强。这说明配伍后,代谢速率降低,会抑制药物中毒性物质的转化或减少有效物质的代谢,有利于药效的发挥。四、大鼠体外肠吸收-肝代谢联动模型评价黄芩黄连多组分体内代谢性相互作用根据中药复方复杂的特点,将体外肠囊法和肝微粒体温孵法相结合,同时启动Ⅰ相、Ⅱ相代谢通路,建立了适合评价中药复杂体系的大鼠体外多组分肠吸收-肝代谢联动模型,以此真实的模拟黄芩黄连在体内的吸收代谢特点和相互作用的过程。分别建立了黄芩黄酮成分和黄连生物碱成分大鼠体内肝代谢HPLC分析方法,研究黄芩中黄酮类成分大鼠体内肝代谢特性。结果显示,黄芩中黄酮类成分与黄连生物碱类成分的代谢特征与单独启动Ⅰ相、Ⅱ相反应体系中的代谢特征不同,Ⅱ相代谢是其体内的主要代谢途径。采用经灌胃诱导的大鼠体外多组分肠吸收-肝代谢联动模型,分别考察黄芩黄连配伍对黄芩和黄连主要成分大鼠体内肝代谢的影响。结果发现,黄连和药对均可抑制黄芩黄酮类成分的代谢,黄连的作用更强;黄芩和药对均可抑制黄连生物碱的代谢,药对的作用更强。五、蛋白质组学法探索黄芩黄连及配伍对肝脏功能蛋白的调控作用首次建立了黄芩、黄连及其药对诱导的大鼠肝组织的蛋白质组学方法,通过双向电泳与MALDI-TOF-MS分析,在实验组和空白组之间共找到78个差异表达蛋白并对其进行鉴定,表明黄芩、黄连及药对能够影响大鼠肝脏的蛋白表达;同时,选择GPX、CAT和BHMT作为代表进行Western blotting验证,其结果与蛋白质组学的分析结果一致。对78种差异表达蛋白的功能进行总结归类,主要涉及氧化应激、脂类代谢、能量代谢、信号转导和细胞骨架等途径。综上所述,本课题从中药复方多组分及其相互作用的研究思路出发,以体内诱导、体外肠囊法相结合的手段,首次对黄芩-黄连的多组分吸收特性及相互作用机制进行研究;针对目前中药复方体外肝代谢研究存在的问题,首次优化了经典的大鼠体外肝微粒体温孵法,将大鼠肠囊法得到的肠渗透液与大鼠肝微粒体进行体外温孵,用于对黄芩和黄连多组分肝代谢的评价;针对中药复方复杂的特点,首次建立了大鼠体外多组分肠吸收-肝代谢联动模型,以此真实的模拟黄芩黄连在体内的代谢特点和相互作用的过程,为其体内研究提供研究基础;首次建立了黄芩、黄连及其药对诱导的大鼠肝组织的蛋白质组学方法,在蛋白水平上直观的看到其所发生的调控,以此来探讨黄芩-黄连的作用靶点,评价其配伍作用机制。本课题采用所建立的体外多组分肠吸收-肝代谢联动模型得到的体外实验结果与体内具有更好的相关性,大大降低了中药复方研究的难度,同时提高了研究的针对性和有效性。这为评价中药复方体内多组分的相互作用提供新的思路,也是建立符合中医药特点的中药药动学研究体系的重要探索。