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酿酒酵母是合成目标产物的模式真核生物,基因操作简单易行,全基因组明确,但是在其细胞内构建遗传性稳定的细胞工厂仍然具有一定的难度。甲羟戊酸是酿酒酵母细胞代谢过程中一种必要的中间产物,承上启下,在代谢网络中发挥着至关重要的作用,更是合成一些具有高附加值物质的前体化合物。本文中以生物炼制作为核心思想,将酿酒酵母细胞改造成为用于生产甲羟戊酸的细胞工厂。针对如何在酿酒酵母细胞内构建高效合成甲羟戊酸的生物合成途径展开了细致的研究。目前,以生物炼制的方法合成甲羟戊酸的大多数研究都是采用大肠杆菌作为宿主细胞进行异源途径的构建,以酿酒酵母作为宿主细胞的研究甚少。在酿酒酵母细胞内使自身代谢产物甲羟戊酸的产量得到积累需要解决以下三个主要问题:减少细胞代谢中的碳损失、削弱竞争性代谢支路减少副产物的产生和机体自身对甲羟戊酸的代谢、维持代谢反应中电子的平衡。首先,分别以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为模板克隆编码磷酸乙酰转移酶的pta基因,以pTRC-fpk/fbp为模板克隆fpk(编码磷酸转酮酶)和fbp(编码果糖-1,6-二磷酸酶),将三种基因共同构建在含有2μ高拷贝复制子的pESC载体上,通过电转化的方式将质粒导入细胞内构建形成NOG途径,使乙酰CoA产量积累。其次,从酿酒酵母基因组中分别克隆编码磷酸葡萄糖脱氢酶和磷酸葡萄糖酸脱氢酶的zwf和gnd基因,加强磷酸戊糖(PPP)途径。PPP途径生成的木酮糖-5-磷酸(X5P),是NOG途径代谢的必需物质。PPP途径的加强,使NOG途径的代谢流增多,进一步增加乙酰CoA积累量。另一方面,单独加强BY4741菌株的PPP途径,发酵液中NADPH浓度由0.085 mM增加至0.17 mM,是BY4741菌株产生NADPH总量的2倍。接下来,按照上述方法,过量表达tHMG1基因(编码3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶),提高甲羟戊酸合成途径中限速步骤的反应效率,使前期改造途径中积累的乙酰CoA,转化为甲羟戊酸。在NOG途径的构建中,选择来自两种不同菌株的pta基因,通过上述构建得到的新菌株其甲羟戊酸含量和细胞生长状态等参数的评定,来自大肠杆菌的pta基因构建得到的菌株BYPNM-EC的甲羟戊酸产量更高,最大产量可达到123 mg/l。故而,选用来自大肠杆菌的pta基因完成NOG途径的构建,BYPNM-EC菌株用于后续途径的构建。最后,削弱竞争性途径。通过敲除BYPNM-EC菌株的pyk1基因减少乙醇的产生,乙醇由1.86 g/l减少至0.66 g/l,且甲羟戊酸产量达到138 mg/l。再敲除ERG8基因部分阻断甲羟戊酸下游反应的代谢流,构建得到高产甲羟戊酸的实验菌株BYM02。BYM02菌株的甲羟戊酸产量可达到180 mg/l,是BY4741菌株甲羟戊酸产量的4.3倍。甲羟戊酸是合成类异戊二烯、萜类物质的重要前体化合物。通过生物炼制的方法能够使甲羟戊酸的合成工艺产业化,降低其合成成本,进而降低以甲羟戊酸作为原料物合成类异戊二烯和萜类物质的成本。酿酒酵母作为可食用性安全菌,可以有效地避免在合成甲羟戊酸的过程中引入内毒素,简化了纯化工艺,降低了合成口服保健品、医疗药物的安全风险。