为优化水牛类精原干细胞的分离、培养体系,本研究对水牛A型精原细胞分离纯化方法,体外增殖的影响因素及其生物学特性进行了探讨。(1)对3-7月龄本地水牛生精上皮细胞类型进行了研究。结果发现,该时期的睾丸生精上皮主要存在三种类型细胞,即支持细胞、间质细胞和A型精原细胞。A型精原细胞存在于管腔基底膜处,细胞核大、着色较深。免疫组化染色的结果显示,水牛A型精原细胞表达Oct-4、c-kit、PGP9.5、THY-1和DBA分子标记蛋白。通过RT-PCR也检测到睾丸组织中有Oct-4、c-kit、PGP9.5和THY-1基因的表达。(2)对水牛生精上皮细胞的分离纯化方法进行了研究。结果发现,采用胶原酶、胰蛋白酶两步酶消化法消化曲精细管能成功得到大量的睾丸细胞,再通过差异贴壁法结合Percoll不连续密度梯度离心法可分离纯化睾丸支持细胞与A型精原细胞。其中支持细胞表达其特异性波形蛋白,可用饲养层制作。(3)对水牛A型精原细胞体外培养特征及类精原干细胞特性进行了研究。结果发现,A型精原细胞接种第2天后开始增殖,10-12天左右形成类精原干细胞克隆。克隆呈碱性磷酸酶染色阳性,表达Oct-4、c-kit、PGP9.5、THY-1精原干细胞特异性因子和牛生殖细胞特异表达的凝集素蛋白DBA。(4)探讨了不同浓度血清和GDNF对A型精原细胞体外增殖效果的影响。结果发现,随着血清浓度的增高,细胞增殖速度加快,形成的DBA阳性克隆数也增多,最适宜血清添加量为2.5%。GNDF对精原细胞分裂增殖和克隆形成数促进作用明显,并呈现一定剂量依赖关系,最适宜添加的剂量为40ng/mL。以上结果表明：(1)3-7月龄的本地水牛睾丸可以分离得到A型精原细胞；(2)水牛A型精原细胞能在体外增殖形成类精原干细胞克隆；(3)在培养液中添加适量的血清和GDNF能促进水牛A型精原细胞的增殖。