【摘 要】
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棉花是世界上重要的经济作物之一。在棉花体细胞胚胎发生的过程中,因棉花体细胞胚胎发生体系效率低等问题,大多数优良棉花品种难以进行遗传转化。即使目前已建立起转基因技术体系材料,但较长的再生周期和较低的再生率限制了棉花基因元件的功能解析,阻碍了棉花分子育种和转基因材料的创制。本研究通过对难再生陆地棉中棉所12（CCRI12）和易再生陆地棉中棉所24（CCRI24）的AINTEGUMENTA-LIKE（A
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棉花是世界上重要的经济作物之一。在棉花体细胞胚胎发生的过程中,因棉花体细胞胚胎发生体系效率低等问题,大多数优良棉花品种难以进行遗传转化。即使目前已建立起转基因技术体系材料,但较长的再生周期和较低的再生率限制了棉花基因元件的功能解析,阻碍了棉花分子育种和转基因材料的创制。本研究通过对难再生陆地棉中棉所12（CCRI12）和易再生陆地棉中棉所24（CCRI24）的AINTEGUMENTA-LIKE（AIL）基因家族表达模式分析,挖掘到一个与胚性愈伤组织发育有关的显著差异表达基因Gohir.D10G099700（GhAIL6）,并进行GhAIL6的克隆和解析其在体细胞胚胎发生过程中的作用。具体研究结果如下:1.从CCRI24中克隆到1473 bp的GhAIL6基因编码序列,通过在Cotton FGD（https://cottonfgd.org/）和TAIR（https://www.arabidopsis.org/）的数据库中比对,得到陆地棉GhAIL6同源蛋白,都含有一个AP2-domain保守结构域,且发现GhAIL6与拟南芥AIL6和AIL7氨基酸同源性最高,推测GhAIL6与拟南芥AIL6和AIL7在调控植物体细胞胚胎发生方面具有相似的功能。2.通过启动子元件预测分析发现,GhAIL6基因的启动子中包含脱落酸应答元件、生长素响应元件、光响应元件和应激响应元件。推测GhAIL6基因可能参与陆地棉生长发育和胁迫响应过程。3.通过烟草荧光蛋白瞬时表达进行亚细胞定位分析,结果表明GhAIL6蛋白定位于细胞核中;根据组织特异性表达模式分析,结果表明GhAIL6基因在棉花胚性愈伤组织中表达量最高,推测GhAIL6基因促进棉花胚性愈伤组织的形成。4.构建过表达载体pCAMBIA2300-GhAIL6,利用农杆菌转化法浸染拟南芥并筛选到T3代进行基因功能鉴定,通过半定量和实时荧光定量证明GhAIL6基因能够在转基因株系中高效稳定表达,通过表型发现GhAIL6转基因株系的叶片明显变大且主根明显变长,表明GhAIL6基因可能促进拟南芥的生长发育。5.构建GhAIL6过表达载体和干涉载体,利用农杆菌转化法将其转化到棉花品种冀合713（Jh713）的下胚轴中进行基因功能鉴定,通过Southern杂交验证得到3个转基因株系（OE1、OE3、Ri7）,对这3个转基因株系以及棉花品种Jh713（CK）进行离体诱导培养。结果表明,GhAIL6基因抑制非胚性愈伤组织的起始和增殖,但是在非胚性愈伤组织向胚性愈伤组织转化的过程中起促进作用。为了探究在体细胞胚胎发生过程中GhAIL6基因对生长素含量的影响,通过液质联用仪对30 d和45 d的GhAIL6转基因株系和对照株系的愈伤组织进行生长素含量测定,结果表明GhAIL6过表达株系的胚性愈伤组织的生长素含量显著高于CK;GhAIL6基因沉默棉株的胚性愈伤组织的生长素含量显著低于CK。推测GhAIL6基因调控棉花体细胞胚胎发生过程,明确了GhAIL6基因在陆地棉体细胞胚胎发生过程中的功能。
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