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DR8基因是在番茄果实成熟过程中通过差异显示技术分离的发育调控基因,属于生长素早期响应基因AUX/IAA家族。已有研究证实DR8基因的启动子受到生长素诱导,但对已分离的1031 bp的DR8启动子片段进行分析,并未发现已知的生长素响应元件;因此,该启动子可能含有新的生长素响应元件。同时启动子上还存在许多已知调控元件,但对DR8是否具有调控作用并不清楚。因此,开展DR8启动子相关研究对明确该基因功能及其调控机制具有重要意义。
本研究构建了4个DR8启动子5’端截短片段的植物表达载体(pBI121-GUS),长度分别为1031 bp、431 bp、236 bp和98 bp,以pBI121-GUS为对照,分别转化烟草。通过GUS染色和酶活测定分析了DR8启动子的组织表达特异性;使用外源生长素处理转基因烟草,根据GUS酶活的变化分析了潜在的生长素响应位点;通过伤害、高温和乙烯等外界条件处理,分析了DR8启动子在部分环境胁迫条件下的表达能力。得到以下主要研究结果:
①扩增了4个DR8启动子5'端缺失片段,长度分别为1031 bp、431 bp、236bp和98 bp,分别插入pBI121-GUS载体,成功构建了含4个不同长度DR8启动子-GUS融合基因的植物表达载体,分别命名为pDR8-1031、pDR8-431、pDR8-236和pDR8-98。
②采用冻融法将所构建的4个DR8启动子-GUS融合基因植物表达载体导入根癌农杆菌菌株GV3101。通过叶盘转化法转化烟草,在kan+选择压力下获得抗性烟草植株,经PCR检测和GUS组织化学染色鉴定,证明DR8启动子-GUS融合基因整合进受体细胞的基因组中,获得了阳性转基因烟草植株。
③GUS染色和酶活测定结果表明,DR8启动子片段驱动GUS基因在烟草叶片组织中有少量表达,在茎和根组织中表达量极低或不表达,且4个DR8启动子片段驱动GUS基因表达的能力均远低于35S启动子驱动外源基因表达的能力。
④转基因植株经0.3 mg/L的2,4-D处理,除了转pDR8-98以外,其他3个启动子片段pDR8-1031、pDR8-431、pDR8-236转基因植株在受生长素刺激后GUS基因均有一定的表达上调,说明在DR8启动子的-236 bp到-98 bp之间存在潜在的生长素响应位点。
⑤物理伤害与100μL/L的乙烯处理不影响转基因烟草叶片组织中GUS基因的表达;在高温环境下,GUS酶活下降,DR8启动子序列上的热激响应元件没有增强启动子的表达作用。