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研究背景和目的:神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)移植和基因治疗,是治疗缺血性脑血管疾病的两个重要的研究途径。近年来,神经干细胞已经被用作基因治疗的载体,可将治疗基因携带到病灶,通过治疗基因在缺血性损伤局部表达而发挥作用,有望为中风的治疗带来新的希望。本研究的目的:以慢病毒(Lentivirus,LV)介导,将hNT-3基因转入NSCs,并进行体外培养,探讨NSCs-hNT3在体外分化以及表达NT-3时间上的特点,为体内移植NSCs-hNT3的研究和临床应用提供必要的体外实验依据。方法:实验共分二部分。第一部分:从孕14天Sprague-Dawley(S-D)大鼠胚胎的脑组织分离出神经干细胞,采用无血清培养法,进行体外培养、扩增,并通过免疫荧光化学染色(巢蛋白)进行鉴定。取传至第5～6代神经干细胞,以1×10~5 cells/500μl/孔接种于24孔板,分别按复感染指数(Multiplicities of infection,MOIs值)为0、1、5、10、15、20加入携带报告基因GFP的慢病毒载体(lentiviralvector-GFP,LV/GFP)稀释液,每一滴度加六孔,共六组。2～3天后于倒置荧光显微镜下观察各组GFP的表达效率,并在3天后进行神经干细胞球进行计数,观察LV/GFP对NSCs增殖的影响。并行流式细胞仪检测,得出各组NSCs的GFP阳性转染率。第二部分:构建表达hNT-3基因的慢病毒载体(lentiviral vector-hNT-3,LV/hNT-3),实验组根据最佳MOI用LV/hNT-3转染NSCs,对照组NSCs不转染病毒。两组细胞继续无血清培养,48h～96h后,应用ELISA和免疫荧光染色方法对两组NSCs在体外的分化和NT-3的表达进行检测。结果:第一部分:NSCs以悬浮细胞球方式生长,nestin染色阳性。转染GFP基因后,除MOI值为0的对照组外,2～3天后各孔均有GFP表达。MOI值从0增至10,细胞的阳性表达率逐渐提高(P＜0.05),MOI值为10的组能获得＞85%的转染率。但MOI值从10增至20,形成的神经干细胞球数目却逐渐减少。第二部分:NT-3修饰的神经干细胞早期跟亲代无形态学区别,3-4天后,实验组中神经干细胞分化比例比对照组明显要高,已分化的细胞在形态上与对照组比较:细胞突起长而且数量多,细胞间突触联系多。转NT-3组神经干细胞,向神经元方向分化的比例明显高于对照组。结论:1) LV是将外源基因转入神经干细胞的理想载体。以MOI为10的滴度,LV可将外源基因高效转入神经干细胞内。2)慢病毒介导转染神经营养素-3基因的神经干细胞体外培养,能高效表达NT-3,向神经元方向分化比例增多,且能形成的突起较长,数量多。