【摘 要】
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该文分两部分：第一部分：地中海拟无枝菌酸菌U32总RNA分离方法及其基因芯片方法初步建立.原核生物的RNA半衰期很短,一般只有几分钟,所以迅速的将细胞裂解并使RNase失活是提取高
【出 处】
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中国科学院研究生院 中国科学院大学
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该文分两部分：第一部分：地中海拟无枝菌酸菌U32总RNA分离方法及其基因芯片方法初步建立.原核生物的RNA半衰期很短,一般只有几分钟,所以迅速的将细胞裂解并使RNase失活是提取高质量RNA的关键.地中海拟无枝菌酸菌属革兰氏阳性菌,细胞壁含厚厚的肽聚糖层,一般的破细胞方法如SDS,玻璃珠等很难将其充分的迅速破碎,因此采用一般的方法很难分离到完整的RNA.在LiCl/Urea法和一步法的基础上提出了一种适用于革兰氏阳性菌RNA的提取方法.首先利用超声波迅速破碎菌体,然后溶液中高浓度的尿素,异硫氰酸胍和LiCl使RNase 失活,并将大分子的RNA沉淀,最后通过酚抽和异丙醇沉淀得纯化的RNA.电泳检查和Northern结果表明采用此方法得到的RNA样品具有很好的纯度和完整性.第二部分：地中海拟无枝菌酸菌U32丙氨酸脱氢酶基因克隆、表达和转录分析.我们根据结核分枝杆菌（M.tuberculosis）和天蓝色链霉菌（S.coelicolor）的丙氨酸脱氢酶氨酶基酸的保守序列和U32对氨基酸密码子的使用偏好,设计一对简并PCR引物.用此引物以U32基因组DNA为模板扩增到一555bp的片段,并以此片段为探针从U32基因组cosmid文库中成功的克隆到了丙氨酸脱氢酶结构基因（ald）.它编码了一个371个氨基酸残基的蛋白,基因的G+C含量为72.5﹪,符合链霉菌的基因结构特征.在起始密码子上海6个碱基处,有一典型的链霉菌核糖体结合位点（RBS）：AGGAGG;第75位的氨基酸为赖氨酸,是丙酮酸结合位点.以Pet28B为载体,在E.Coli BL21(DE3)中高效表达了ald基因.用IPTG在22℃时诱导得到的丙氨酸脱氢酶比活力最高.用His-Tag柱纯化了表达的丙氨酸脱氢酶,该酶专一性以L-Ala和NAD(H)为底物.利用Northern blot分析了不同氮源条件下丙氨酸脱氢酶基因的转录水平.
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