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背景:内毒素血症(ETM)是由血中细菌或病灶内细菌释放出大量内毒素至血液,或输入大量内毒素污染的液体而引起,发生时,心脏是主要受累器官之一,伴心功能障碍ETM患者的病死率高达70%~90%。然而,如何预防、治疗ETM所致心功能障碍,降低病死率,延长生存时间,临床上目前没有有效的方法。因此,研究ETM致心功能障碍的分子机制,寻找有效靶点,倍显重要。TRPC是经典瞬时感受器电位通道蛋白。近年研究发现,TRPC蛋白在神经系统发育,神经元存活,心脏起搏、传导和收缩,缺氧性肺血管收缩,心肌肥大和肺动脉高压等诸多病理和生理过程中起着关键作用。我们研究发现:脂多糖(LPS)诱导的ETM小鼠心肌TRPC1和TRPC6通道蛋白表达显著升高,提示TRPC可能重要性地参与了LPS诱导小鼠心功能障碍的过程。目的:本课题采用药理学和基因敲除相结合的手段,应用分子生物学技术和超声影像等动物组织器官功能学相关实验,从分子、组织器官和整体水平明确TRPC在ETM致小鼠心功能障碍发病机制中的作用,阐释TRPC参与ETM致心功能障碍的分子机制,为寻找有效防治ETM的作用靶点和后续的药物研发提供实验依据和思路。方法:(1)腹腔注射40 mg/kg LPS建立ETM小鼠模型。检测LPS刺激后,心肌组织TRPC通道各亚型蛋白表达和相关亚型蛋白表达随时间的变化;应用免疫荧光技术检测TRPC亚型在心脏组织的表达和定位;分别给予野生型小鼠(WT),Trpc1和Trpc6基因敲除小鼠(Trpc1-/-和Trpc6-/-)LPS刺激,利用HE染色法比较各组小鼠心肌组织形态学变化,采用M型-超声影像系统(M-Echo)检测各组小鼠心功能,绘制生存曲线,比较各组小鼠生存情况。(2)LPS刺激后:采用Real time-PCR检测WT、Trpc1-/-和Trpc6-/-小鼠心肌中Tnf-α,Il-1β,Il-6,Tlr2,Tlr3,Tlr4,Traf6,Gapdh,Myd88,Trif,Gsh-px1,Calcineurin,I?Bα,Ap1,Nox2,Calmodulin,Nox4,Ncf1,Ncf2,Nrf2,Caspase3,Tirap和Tab2等的mRNA表达水平的变化;采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组小鼠心肌组织炎性细胞因子TNF-α、IL-1?、IL-6和IL-10表达水平的变化;利用蛋白免疫印迹技术(WB)检测各组小鼠心肌组织炎症通路相关分子(TLR4、MyD88、TRAF6、IRAK1、IRAK4、TRIF、TIRAP和TRAM)、MAPK通路相关分子(ERK1/2、JNK、p38和ERK5)以及NF-?B信号通路相关分子(p65,I?B?和IKK)蛋白表达和磷酸化水平的变化,同时检测各组小鼠心肌CaM蛋白表达的变化;采用免疫共沉淀法(Co-IP)测定TRPC1/6与相关通路蛋白的相互作用。(3)分别给予ETM小鼠腹腔注射低、中、高剂量(5 mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg)的非选择性TRPC抑制剂SKF96365,利用HE染色法和M-Echo检测给药组小鼠心肌组织病理损伤和心功能与溶剂对照组的差异,绘制生存曲线,评价各组小鼠生存情况。结果:(1)成功建立了ETM小鼠模型。与溶剂对照组比较,LPS刺激后,WT小鼠心肌中TRPC1和TRPC6蛋白表达水平显著升高,分别是溶剂对照组的1.6±0.2倍和1.9±0.2倍(P<0.05),其他亚型蛋白表达变化没有显著差异(P>0.05)。WT小鼠腹腔注射LPS后,于1~12 h观察TRPC1和TRPC6蛋白表达的变化,WB结果显示:TRPC1蛋白表达随时间呈现先升高后降低的变化趋势,3 h达峰值,且是0 h的1.5±0.1倍(P<0.05);TRPC6蛋白表达随时间也呈现先升高后降低的变化趋势,于2 h达峰值,且是0 h的2.6±0.1倍(P<0.05)。免疫荧光实验结果显示:LPS刺激后,TRPC1和TRPC6蛋白荧光强度于3 h均显著增强,分别是0 h的2.6±0.2倍和3.1±0.3倍(P<0.05)。蛋白表达定位实验结果表明:LPS刺激后,TRPC1和TRPC6蛋白表达在心肌细胞显著升高。LPS刺激4 h后,应用M-Echo检测各组小鼠心功能变化,结果显示WT小鼠的左室射血分数(LVEF)由69.5±2.74%下降至35.2±1.26%,左室缩短分数(LVFS)由32.9±2.07%下降至13.5±0.57%。同样,LPS刺激后,Trpc1-/-小鼠的LVEF由71.3±3.23%下降至45.0±1.55%,LVFS由34.6±2.23%下降至18.1±0.76%;Trpc6-/-小鼠的LVEF由64.7±1.81%下降至50.8±0.53%,LVFS由29.4±1.24%下降至21.1±0.28%。结果表明:LPS刺激后,Trpc1-/-和Trpc6-/-小鼠的LVEF和LVFS明显高于WT小鼠,提示TRPC1和TRPC6可能重要性地参与了LPS诱导小鼠心功能障碍的过程。心肌组织形态学研究结果显示:WT小鼠腹腔注射LPS 4 h后,心脏组织间质内有炎性细胞浸润,部分心肌细胞空泡变性。Trpc1-/-和Trpc6-/-小鼠给予LPS 4 h后,心肌组织结构较为清晰,间质内炎性细胞浸润均相对较少。生存分析实验结果表明:各组小鼠腹腔注射LPS后,在80 h观察期内,WT小鼠死亡率为100%,Trpc1-/-和Trpc6-/-小鼠死亡率均为30%,提示:LPS刺激后,Trpc1-/-和Trpc6-/-小鼠生存率从0%提高到70%,显著高于WT小鼠(P<0.05)。(2)ELISA结果显示:LPS刺激后,WT小鼠血清中TNF-α表达水平由50.5±4.3 pg/?l升高到176.0±4.5 pg/?l,IL-1?表达水平由13.2±1.6 pg/?l升高到34.1±1.5 pg/?l,IL-6表达水平由0.5±0.8 ng/?l升高到1.8±0.1 ng/?l;Trpc1-/-小鼠血清中TNF-α表达水平由56.6±2.1 pg/?l升高到72.3±3.1 pg/?l,IL-1?表达水平由16.2±0.7 pg/?l升高到24.6±0.8 pg/?l,IL-6表达水平由0.6±0.1 ng/?l升高到1.16±0.1ng/?l;Trpc6-/-小鼠血清中TNF-α表达水平由65.5±4.2 pg/?l升高到80.0±7.1 pg/?l,IL-1?表达水平由(17)(16)(13)(15)±1.4 pg/?l升高到27.2±1.7 pg/?l,IL-6表达水平由0.5±0.1 ng/?l升高到0.9±0.1 ng/?l。结果表明:LPS刺激后,Trpc1-/-和Trpc6-/-小鼠血清中促炎性细胞因子的表达水平显著低于WT小鼠(P<0.05)。另外,LPS刺激后,WT小鼠血清中IL-10表达水平由10.4±1.7 pg/?l升高到16.4±3.0 pg/?l,Trpc1-/-小鼠血清中IL-10表达水平由24.2±1.1 pg/?l升高到36.0±4.7 pg/?l,Trpc6-/-小鼠血清中IL-10表达水平由21.6±1.6 pg/?l升高到40.7±3.6 pg/?l。结果表明:LPS刺激后,Trpc1-/-和Trpc6-/-小鼠血清中IL-10表达水平显著高于WT小鼠(P<0.05)。WB和real-time PCR实验结果发现,在转录和翻译水平,LPS刺激后,与WT小鼠比较,Trpc1-/-和Trpc6-/-小鼠心肌中TLR4-MyD88-TRAF6信号通路的活化以及下游的MAPK和NF-?B信号通路的活化均被显著抑制。Co-IP实验结果表明:CaM与TRPC1,TRPC6,TLR4,MyD88和TRAF6蛋白均有相互结合,且在LPS刺激后,结合量增多,分别是溶剂对照组的3.52±0.6倍,2.71±0.5倍,3.02±0.4倍,1.57±0.2倍和2.56±0.3倍(P<0.05)。(3)采用M-Echo检测各组小鼠心功能,结果显示,非选择性TRPC抑制剂SKF96365低、中、高剂量治疗组小鼠的LVEF和LVFS分别为41.8±1.70(4),49.3±1.40(4),56.3±2.08(4)和16.6±0.81(4),20.3±0.73(4),24.2±1.24(4),与ETM小鼠的LVEF(35.4+2.39(4))和LVFS(13.6±1.08(4))相比可知,SKF96365能剂量依赖性地改善ETM小鼠心功能。组织形态学结果也表明,SKF96365能剂量依赖性地减轻LPS诱导的小鼠心肌组织炎性病理损伤。继而生存分析实验结果发现,在60 h观察期内,LPS组小鼠生存率为10%;单次给予SKF96365的低、中、高治疗组小鼠生存率分别为10%,20%和30%;连续3次给予中剂量的SKF96365,ETM小鼠生存率达到70%,与LPS组比较,生存率显著提高。结论:(1)TRPC1和TRPC6参与了LPS诱导小鼠心功能障碍的过程。敲除TRPC1或TRPC6能明显减轻ETM小鼠心肌组织炎性病理损伤,显著改善其心功能,显著提高其生存率。(2)TRPC1和TRPC6可通过抑制ETM小鼠心肌CaM表达,减少其与炎症通路中TLR4,MyD88和TRAF6蛋白的结合,放大炎症反应通路信号级联。(3)非选择性TRPC抑制剂SKF96365可明显减轻ETM小鼠心肌组织炎性病理损伤,显著改善其心功能,显著提高其生存率。TRPC是潜在的ETM致心功能障碍的药物治疗新靶点。