杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy,DMD）是一种X连锁隐性遗传的致死性肌肉变性疾病，主要由编码抗肌萎缩蛋白(dystrophin)的DMD基因突变导致，临床表现为进行性加重的肌肉损伤。目前该病尚无有效的治疗手段，主要通过糖皮质激素和康复训练等临床综合治疗来延缓疾病进程，但即使有医疗护理，大多数DMD患者多在30岁之前死于心脏或呼吸衰竭。　　近年来CRISPR/Cas9技术被广泛应用于DMD的基因治疗研究中。CRISPR/Cas9基因编辑系统可对特定序列进行靶向编辑，实现对DMD基因永久性靶向外显子跳跃，校正突变破坏的阅读框架从而恢复dystrophin蛋白的表达。目前已有大量体内外研究评估CRISPR/Cas9治疗DMD的效果，其成功率各不相同。尽管CRISPR/Cas9介导的基因编辑在DMD的长期治疗中已显示出一定潜力，但其临床转化应用中仍面临着脱靶，体内基因递送和免疫应答激活等诸多安全性问题。因此CRISPR技术的安全性评价是我们研究的重点。本研究在体外确定并构建小鼠Dmd基因23外显子上下游的高效靶点。同时在小鼠体内通过活体荧光成像技术评价AAV9的分布及表达情况确定AAV9病毒载体的合适注射方式和剂量。此外本研究还评价了SaCas9蛋白抗体在人体内的存在情况，为后续DMD基因治疗安全性研究提供实验基础。　　目的：　　1、设计、构建mdx小鼠Dmd基因23号外显子上下游的sgRNA，在HePa1-6小鼠肝病细胞(C57BL小鼠)中验证单、双靶点的编辑效果，确定高效的靶点。　　2、分析不同注射方式、不同病毒滴度的AAV9病毒载体在小鼠体内的分布及表达情况，初步确定合适的病毒注射方式及剂量。　　3、检测人体及胎儿体内是否存在SaCas9蛋白抗体，从而为CRISPR-SaCas9治疗DMD患者时的可能存在的体液免疫情况提供研究基础。　　方法：　　1、设计靶向mdx小鼠Dmd基因23号外显子上下游区域的sgRNA序列，在HePa1-6小鼠肝病细胞(C57BL小鼠)中通过T7E1检测或电泳检测分别验证单、双靶点的切割活性。　　2、构建携带Luciferase荧光报告基因的ssAAV-Luciferase质粒，经腺相关病毒9型（AAV9）包装后，通过尾静脉注射和肌肉注射两种方式，向4～6周的雌性Balb/c nude小鼠分别注射不同滴度的病毒，正常饲养3天后，于生物荧光成像仪下观察ssAAV-Luciferase在小鼠体内的表达情况。　　3、收集孕妇于我中心产前检测后废弃的血清、羊水、胎儿脐带血，取得患者及家属同意后，通过ELISA法检测SaCas9蛋白的抗体。　　结果：　　1、成功构建针对mdx小鼠Dmd基因23号外显子5端重组质粒2个(L1，L2)，3端重组质粒2个（R1，R2），经T7E1检测确定单靶点R1具有较高的切割活性。电泳检测确定23号外显子上下游的L1和R1靶点组合时(L1+R1)，双靶点的切割活性最高。　　2、尾静脉注射AAV9时，病毒可在小鼠体内均匀且广泛的分布和表达。肌肉注射时病毒在注射部位局部表达最为强烈，注射部位以外也有少量表达。随着AAV9病毒注射剂量增高，病毒在体内的分布越广泛，表达越强烈。当肌肉注射1.261×1013vg/kg时，病毒表达局限在注射部位局部及四肢、膈肌等肌肉组织中，其他脏器未见明显表达。　　3、在随机选取的42例正常孕妇的血清样本中，均可检测到SaCas9蛋白抗体，23例羊水及10例脐带血样本中未检测出SaCas9蛋白抗体。　　结论：　　1、本研究我们成功利用CRISPR/Cas9系统，在HePa1-6细胞中筛选出针对Dmd基因23号外显子两端的高效sgRNA，证实在小鼠细胞中进行23号外显子靶向敲除的可行性。　　2、初步得出肌肉注射是AAV9载体介导CRISPR/Cas9治疗DMD时较为合适的治疗方式，1.261×1013vg/kg是较为合适的注射剂量。　　3、SaCas9蛋白抗体在成人体内广泛存在，羊水和脐带血内均未检测出。