酚类物质是一类典型的环境内分泌干扰物,人群暴露广泛。以往的动物和体外实验发现酚类物质暴露与男性生殖损害有关,然而这些研究缺乏人群流行病学证据支持且生殖毒性机制尚未阐明。男性不育是环境因素和基因因素共同作用的结果,故而环境-基因交互作用是目前研究化学物毒性易感性的研究热点。另外,代谢组学作为一门新兴的组学技术,在生殖毒理学研究中具有极大的潜力与价值。故而本研究关注酚类物质暴露与男性生殖,采用环境与遗传并进、人群加动物的整体研究策略。我们先建立了基于超高效液相色谱串联质谱检测人尿液中酚类物质的方法;并借助该方法检测了中国普通人群尿液中酚类物质暴露水平,探讨了酚类物质暴露与男性生殖的流行病学关联;并进一步分析了代表性酚类物质4-t-辛基酚的生殖毒性在不同Y染色体单倍群背景下易感性的差异;最后采用代表性酚类物质双酚A的大鼠染毒模型,开展了多分析平台联合的睾丸和尿液的代谢组学研究,发现了双酚A暴露的生物标志并揭示了双酚A暴露对雄性生殖损伤的毒性机制。这些研究为酚类物质的潜在男性生殖毒性提供了人群流行病学证据和全新的认识,为酚类物质的男性生殖危害评价提供了基础资料。第一部分酚类物质暴露与男性生殖异常的流行病学研究第一节尿液中酚类物质检测方法的开发前言酚类物质的暴露是否危害人类健康是重要的公共卫生问题。然而,同时检测多种酚类物质的内暴露水平的方法还很缺乏。本研究基于超高效液相色谱串联质谱技术首次开发了检测人尿液中九种酚类物质的方法,包括双酚A,2,3,4-三氯酚、2,4,5-三氯酚、二苯甲酮-3、五氯酚、三氯生、4-t-辛基酚、4-n-辛基酚和4-n-壬基酚。方法1.采用β-葡糖苷酸-芳基硫酸酯酶酶解尿液;2.采用Envi-18固相萃取小柱提取和预浓缩目标酚类物质;3.采用超高效液相色谱串联质谱分离目标酚类物质并采用多反应监测模式进行酚类物质定量检测。结果1.方法的灵敏度:检测限0.02-0.9μg/l;2.方法的稳定性:日内精密度2-41%,日间精密度3-38%;3.方法的回收率:78-138%;4.方法线性范围:0.03-50μg/l;5.基于此方法检测了325名来自中国普通人群的志愿者尿液中酚类物质的含量,发现中国普通人群有较为普遍的酚类物质暴露。结论本研究首次开发了基于超高效液相色谱串联质谱技术的高通量检测尿液中酚类物质的灵敏、准确、稳定的方法,为酚类物质内暴露水平检测和酚类物质暴露与疾病关联的流行病学研究提供了可行有效的检测方法。本部分研究还首次报道了中国人群酚类物质内暴露水平的基线资料。第二节酚类物质暴露与男性不育及精液参数异常的相关性研究前言酚类物质具有内分泌干扰效应,体外和动物实验广泛报道其暴露与男性生殖损伤有关,然而人群中酚类物质暴露是否与男性不育有关依然缺乏流行病学证据。本研究采用病例对照的设计研究酚类物质暴露与男性不育及精液参数异常的相关性。方法1.采用已开发的基于超高效液相色谱串联质谱技术的方法分析中国普通人群877例男性不育及713例正常生育对照尿液中酚类物质的浓度;2.对上述人群的精液参数进行分析;3.用多元Logistic回归和趋势性检验分析酚类物质暴露与男性不育及精液参数异常的相关性。结果1.中国普通人群的男性有较为普遍的酚类物质的暴露,暴露水平从高到低依次是三氯生、五氯酚、二苯甲酮-3、4-t-辛基酚、4-n-壬基酚和4-n-辛基酚。2.4-t-辛基酚、4-n-辛基酚和4-n-壬基酚暴露与男性不育有关,趋势性检验p值分别为<0.0001,0.014和0.001。3.双酚A暴露、4-t-辛基酚和4-n-壬基酚暴露与异常精液参数有关。4.烷基酚联合暴露(4-t-辛基酚、4-n-辛基酚和4-n-壬基酚)与男性不育及异常精液参数有关。结论本研究首次基于大样本人群探讨了酚类物质暴露与男性不育及精液参数异常的相关性,为酚类物质的男性生殖毒性提供了流行病学证据。第三节代表性酚类物质男性生殖毒性的遗传易感性研究前言男性不育是环境因素和遗传因素共同作用的结果。4-t-辛基酚暴露与男性不育及异常精液参数在中国普通人群具有较强的关联,故而进一步探讨不同遗传背景下的人群对4-t-辛基酚的生殖毒性的易感性差异对进一步深化对4-t-辛基酚的男性生殖毒性认识具有重要的意义。Y染色体单倍群与男性生殖密切相关,在遗传背景研究中非常重要。本研究采用病例对照研究设计探讨Y染色体单倍群对代表性酚类物质(4-t-辛基酚)生殖毒性的易感性的影响。方法1.采用已开发的基于超高效液相色谱串联质谱技术的方法分析了774例男性不育及520例正常生育对照尿液中4-t-辛基酚的浓度;2.在上述人群中采用SNa Pshot方法分类了10个Y染色体单倍群;3.用似然比检验分析Y染色体单倍群的对4-t-辛基酚生殖毒性易感性的影响,计算假阳性率来控制多重检验假设带来的假阳性错误率。结果1.4-t-辛基酚的暴露在本研究各Y染色体单倍群中均提高了男性不育的风险。2.Y染色体单倍群O3*人群相比非本群男性对4-t-辛基酚的潜在生殖毒性不易感(pinter=1.1e-3)。结论本研究首次分析了十种Y染色体单倍群下4-t-辛基酚生殖毒性易感性的分布情况,说明了中国男性普遍对4-t-辛基酚的生殖毒性易感,揭示了O3*单倍群一定程度上降低了4-t-辛基酚致男性不育的风险。本研究强调了以后需要更为广泛地开展Y染色体单倍群相关的功能研究和Y染色体单倍群与化学物毒性的易感性研究。第二部分代谢组学在代表性酚类物质致雄性生殖毒性机制研究中的应用前言流行病学研究发现双酚A暴露与精子发生异常有关,而双酚A的生殖毒性机制尚未完全阐明。代谢组学在生殖毒理学研究中具有应用潜力,尚无有关代谢组学应用于双酚A生殖毒性研究的报道。本研究选择双酚A为代表性酚类物质,采用大鼠染毒双酚A模型,分析睾丸和尿液代谢谱变化,探索双酚A的生殖毒性机制。方法1.将18只大鼠随机分为1个溶剂对照组和2个双酚A染毒组(0.0005,50mg/kg/d),采用灌胃法连续染毒8周;2.睾丸和尿液采用液相色谱串联四级杆飞行时间质谱进行非靶标代谢组学分析,采用精确分子量、同位素分布、数据库比对、标准品比对等多种方法鉴定生物标志;3.根据睾丸代谢谱提示的信息,用分光光度法试剂盒测定睾丸超氧物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性;4.尿液采用毛细管电泳串联飞行时间质谱进行高通量代谢谱分析,采用标准品库定性内源性化学物;5.肝脏蛋氨酸腺苷转移酶Iα(Mat1a)和蛋氨酸腺苷转移酶IIα(Mat2a)的m RNA和蛋白水平分别采用RT-PCR和Western blot检测;6.计算假阳性率来控制多重检验假设带来的假阳性错误率,用KEGG数据库对结果进行生物信息学分析。结果1.双酚A染毒组尿液中葡萄糖醛酸苷结合型双酚A显著上升;2.睾丸代谢谱:采用多种方法鉴定出了双酚A暴露大鼠睾丸的潜在生物标志-亚油酸和花生四烯酸,双酚A暴露对大鼠睾丸不饱和脂肪酸的代谢产生了影响使得花生四烯酸上升,亚油酸下降,花生四烯酸/亚油酸比值上升,大鼠超氧物歧化酶活性在双酚A染毒后发生显著下降,谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶活性出现了下降趋势;3.尿液代谢谱:双酚A导致甲基化氨基酸、甲基化嘌呤上升,尿素循环增强,核酸降解增强,水溶性维生素排出增多,胆碱相关代谢增强,肝脏编码胆碱代谢通路关键酶的基因mat1a和mat2a的m RNA和蛋白水平均显著上升。结论本研究发现了代表性酚类物质双酚A暴露的睾丸生物标志,双酚A影响了睾丸的脂肪酸代谢,降低了睾丸的抗氧化能力;通过增强胆碱代谢相关关键代谢酶的基因表达,增强胆碱代谢引起了体内高甲基化环境导致异常的蛋白降解和DNA损伤效应从而可能引起生殖毒性。本研究首次从代谢组学角度为双酚A的生殖毒性提供了新的视角,并说明了代谢组学在生殖毒理学研究领域的潜在意义和应用价值。